多重PCR技术在转基因成分检测中的最新研究进展

鲁 军， 李 刚， 赵建宁， 杨殿林， 修伟明

(1. 农业部环境保护科研监测所 农业部转基因生物生态环境安全监督检验测试中心， 天津 300191；2. 沈阳农业大学 植物保护学院， 沈阳 110866)

自从1994年转基因番茄在美国第一次商品化种植以来，转基因技术已成为推动农业科技和农业生产的主要技术，转基因作物(Genetically modified crops，GMC)由此得到了迅速发展[1]。GMC诞生以来种植面积不断扩大，种植品种不断增多，已经对传统农业技术产生了巨大冲击。1996—2016年的这20年间，全世界GMC的播种总面积连年大幅增加，已达21亿km2[2]。虽然转基因技术的快速发展给农业生产和食品工业带来巨大变革，但是其食用安全和环境安全却受到了普遍关注[3-4]。全球很多国家和国际组织制定了一系列与转基因相关的法律法规，甚至对含有一定转基因成分或来源转基因产品的商品施行不同转基因标识制度[5-7]，以此保证消费者的选择权和知情权。目前，用于转基因成分检测的技术大致可划分为两种：一是对核酸进行检测，该检测技术主要包括定性PCR、定量PCR、巢式PCR、数字PCR、依赖核酸序列扩增技术、环介导等温扩增技术、基因芯片、Southern印记杂交和Nouthern印记杂交；二是对外源蛋白质进行检测，该检测技术主要包括酶联免疫吸附法、蛋白质印迹法、试纸条法。现有基于核酸与外源蛋白质的检测技术都存在一些局限性，如通量低、检测时间长、成本高、需要特殊的仪器设备等。因此发展便捷、高效、低成本、高通量的检测技术，是保障转基因产业发展的必要条件。随着转基因技术的快速发展，GMC及其衍生产品越来越多，采用传统普通PCR检测方法已经不能达到同时检测GMC多基因多品种的需求。相比之下，正是由于多重PCR(Multiplex PCR)技术具有传统PCR不可比拟的优势，因而Multiplex PCR技术已经在转基因成分识别和检测中发挥着重要作用。本文对Multiplex PCR在转基因成分不同检测需求方面的应用以及与其他技术相结合的最新进展进行了总结，并提出了持续改进的策略。

1 Multiplex PCR关键技术要素

Multiplex PCR是在普通PCR基础上发展而来。由于Multiplex PCR是在同一个PCR反应体系中加入了多对特异性引物，对多个目标片段进行扩增，因此与普通PCR相比，实现该技术的难度也成倍增加。Multiplex PCR检测体系并不是将多个单重PCR检测体系进行简单的叠加而成，而是需要在多方面分析检测目的片段的基础上，对Multiplex PCR的反应体系和反应条件进行反复试验、优化、验证，获得最优反应体系。以下几个技术要素对于Multiplex PCR检测体系尤为重要：

1)Multiplex PCR扩增目标片段的选择。必须有高度特异性，片段长度要有明显的差异，建议片段长度不超过400 bp；便于后续进行鉴别[8-9]。2)Multiplex PCR引物设计。必须有高度特异性，彼此无同源性，单条引物的长度一般为18～25个碱基，引物中4种碱基的比例要适当，G+C含量一般为40%～60%[10-11]。3)TaqDNA聚合酶的反应浓度。Multiplex PCR是多个扩增反应同时进行，各个扩增反应之间会相互竞争TaqDNA聚合酶，因而扩增效率相对较低的扩增反应将会受到抑制，添加适量浓度的TaqDNA聚合酶可以有效地减弱抑制作用[12]。4)反应体系引物终浓度。筛选出最优引物终浓度组合至关重要，可一定程度上保证各扩增反应的效率相近。5)退火温度。通常退火温度比模板-引物解链温度(Tm)要低5℃～10℃。

2 Multiplex PCR在转基因成分检测中的应用

2.1 Multiplex PCR对通用元件的检测

由于不同GMC所使用的外源基因和筛选元件的种类和次数各不相同，如果按通常仅检测CaMV35S启动子和NOS终止子的策略进行检测，很容易出现漏检和误检的情况[13]。因此，为了更好地保证检测结果的准确性，最好在转基因成分检测过程中同时针对多个外源基因和筛选元件进行检测。

Singh等[14]以CaMV35S启动子、CaMV35S终止子、NOS终止子、PAT、NPTII、Adh1、Sad1为检测目标，建立了转基因玉米和转基因棉花的Multiplex PCR检测方法，对已经批准商品化的转基因棉花和转基因玉米的检测，检出率可达93%和94%，检出限分别为0.25%和0.5%。尹全等[15]以CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS为检测参数建立了转基因大豆Multiplex PCR检测方法，检测的灵敏度不低于1 ng。李忆等[16]以CruA、T-CaMV35S、P-CaMV35S、PAT为检测靶标通过对引物终浓度和退火温度的优化，建立了转基因油菜Multiplex PCR检测方法。尹全等[17]还以PMI、CaMV35S启动子、RACT1启动子、NOS终止子、BAR、PAT等6个参数为检测目标建立了转基因玉米的Multiplex PCR检测方法。张欣等[18]以G10evo-EPSPs、cry1Ab/cry2Aj、cry1Ie为检测靶标，建立了转基因玉米Multiplex PCR检测方法。陈贞等[19]还以Sad1、GUS、Cry1Ab/Ac、NPTII、CaMV35S启动子、NOS终止子为检测目标，建立了转基因棉花Multiplex PCR检测方法，此检测方法只需一颗棉籽就可检测出转基因成分。魏霜等[20]建立了基于SPS、Cry1Ab、Cry1Ab/Ac、Btc、GUS、NOS终止子、CaMV35S启动子的七重PCR检测方法，能有效检测出水稻、大豆、玉米、棉花籽、菜籽粕中的转基因成分。

2.2 Multiplex PCR技术对基因特异性的检测

基因特异性检测是以外源基因为检测靶标进行特异性检测。目前以转基因植物中的抗虫基因和耐除草剂基因为靶标，应用Multiplex PCR技术进行转基因成分检测的比较多，而针对抗病毒基因、抗逆基因和品质改良基因检测方面的研究则相对较少。

Guo等[21]建立了以Cry1Ab、Cry3A、Cry1Ac、Cry1A(b/c)、Cry3Bb1、PAT、CP4-EPSPS、BAR等基因为靶标的Multiplex PCR检测方法，检出限约为80个拷贝。李飞武等[22]应用普通PCR与Multiplex PCR技术检测含有Bt基因的GMC，结果表明所采用的两种方法都可准确的检测出所检样品中含有的Bt基因成分。Ao等[23]建立了适用于转基因大豆、玉米、水稻中CP4-EPSPS、Cry1A(b)、BAR、PAT基因检测的多重巢式PCR方法，检测灵敏度为0.005%。

2.3 Multiplex PCR技术对转化事件特异性的检测

在转基因成分检测过程中，转化事件特异性检测是针对外源插入基因和宿主DNA之间连接区域为靶标进行检测，较基因特异性检测和构建特异性检测具有更高的特异性[24]。转化事件特异性检测已被广泛应用于转基因成分检测[25-26]。

Kim等[27]建立了针对转基因玉米MON863、MON810、T25、TC6275、DAS59122-7、NK603、TC1507、MON89034、MIR162、BT176、3272、MIR604、MON88017、BT11、LY038、GA21的Multiplex PCR检测方法，可用于食品和饲料中转基因成分的检测，检出限为0.25%。李会等[28]以转基因玉米MON863、BT176、MON810、NK603为检测对象，建立并完善了四重 PCR检测方法，该方法能有效检测出4种转基因玉米，与普通PCR方法相比，所产生的废液可减少75%，检测时间可缩短63%，检测成本可降低75%。尹全等[29]以转基因玉米BT11、MON810、BT176、MON863等为检测对象，建立了Multiplex PCR检测方法，检测灵敏度为100个拷贝。董立明等[30]以转基因大豆MON89788、GTS40-3-2、CV127、305423、356043为检测对象，建立了Multiplex PCR检测方法，检测灵敏度为0.1%。Lu等[31]和Wang等[32]以转基因水稻KF6、KMD1、TT51-1为检测对象，建立了Multiplex PCR检测方法，检出限为0.1%。Kim等[33]建立了转基因棉花MON88913、MON1445、LLcotton25、MON15985的Multiplex PCR检测方法，该多重体系的检出限为1%。鲁军等[34]以转基因油菜RF1、MS8、Topas19/2、Oxy235、RF3建立了Multiplex PCR检测方法，其检出限为0.05%。

通过比较可发现，Multiplex PCR的检出限与普通PCR相近，但Multiplex PCR检测的成本更低、通量更高、节省实验样品和试剂，对于检测多参数、大批量或珍贵的实验样品更具有优势。可推测Multiplex PCR技术在未来的转基因成分检测过程中将发挥更重要的作用。

3 Multiplex PCR与其他技术的有效结合

将Multiplex PCR技术与其他技术相结合，可将转基因成分检测的灵敏性和特异性提高，也可大大缩短检测时间。

3.1 多重实时荧光PCR技术在转基因成分检测中的应用

多重实时荧光PCR技术是将高通量的Multiplex PCR技术与高灵敏度的实时荧光PCR技术整合在一起的技术。此技术是将多条特异性引物加到实时荧光PCR反应体系中，实现定性或定量检测GMC及其衍生产品中的转基因成分[35]。目前，多重实时荧光PCR技术已在转基因成分检测中得到验证和应用，其操作简单、重复性好、快速高效、通量高、灵敏度高、特异性强、减少交叉污染与环境污染、自动化程度高、既可定量分析又可定性分析。

Köppel等[36]针对FMV启动子、CaMV35S启动子、NOS终止子、CaMV35S终止子、PAT、CP4-EPSPS、CPT2开发了2个多重实时荧光PCR检测体系，检出限达到0.1%。Huber等[37]以CaMV35S启动子、NOS终止子、BAR、PAT、CTP2-CP4EPSPS等参数为靶标，建立了多重实时荧光PCR检测方法，检出限为20个拷贝。Samson等[38]以转基因玉米MON810和GA21为材料，建立了多重实时荧光PCR检测方法，检出限为3个拷贝。Chaouachi等[39]建立了二重实时荧光PCR方法检测转基因油菜Oxy235，检出限小于5个拷贝。付伟等[40]以Lectin基因和转基因大豆DAS44406-6品系为检测对象，建立了多重实时荧光PCR检测体系，检测灵敏度为0.01%。付伟等[41]还针对Lectin基因和转基因大豆DAS81419品系开发了多重实时荧光PCR检测体系，检测灵敏度为0.01%。

3.2 Multiplex PCR-变性高效液相色谱技术在转基因成分检测中的应用

变性高效液相色谱(DHPLC)是在单链构象多态性和变性梯度凝胶电泳基础上发展起来的一种快速检测PCR扩增产物的技术[42]。DHPLC与琼脂糖凝胶电泳相比，在检测通量、特异性、灵敏度、结果重复率、自动化程度、检测DNA片段长度范围等方面更具优势。将Multiplex PCR技术与DHPLC方法相结合所形成的Multiplex PCR-DHPLC技术正逐渐应用到转基因成分检测中。

向才玉等[43]以转基因棉花MON15985、MON531和MON1445为材料，建立了Multiplex PCR-DHPLC检测方法。白月等[44]针对转基因小麦B73-6-1品系，建立了Multiplex PCR-DHPLC检测技术，该方法可同时对5个基因进行检测，灵敏度为1 ng/μL。陶然等[45]建立了转基因大豆及其食品检测的Multiplex PCR-DHPLC技术，此方法的检测灵敏度为0.078 ng/μL。

3.3 多重巢式PCR技术在转基因成分检测中的应用

巢式PCR原理是先以靶标DNA作为第一轮扩增反应的模板，第二轮扩增反应所需要的模板来源于第一轮的PCR扩增产物，第二轮的PCR扩增产物即为目的片段。多重巢式PCR技术是将巢式PCR和Multiplex PCR两种技术相结合，具有特异性强、通量高、灵敏度高等诸多优点。Ao等[23]以转基因玉米、转基因水稻、转基因大豆中的Cry1A(b)、CP4-EPSPS、BAR、PAT基因为靶标建立了多重巢式PCR方法，灵敏度可达0.005%。张明辉等[46]以Lectin、EPSPS-NOS和35S-CTP基因为靶标，建立了可检测大豆深加工产品中转基因成分的三重巢式PCR检测方法。

3.4Multiplex PCR-毛细管电泳技术在转基因成分检测中的应用

毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的一种新型液相分离技术[47]。与琼脂糖凝胶电泳相比，毛细管电泳耗时短、分辨率高、重现性好、无需使用致癌的EB染料。将高特异性的Multiplex PCR技术与高分离度的毛细管电泳技术相结合的技术，被称之为Multiplex PCR-毛细管电泳技术。

张春娇等[48]用建立的Multiplex PCR-毛细管电泳技术检测了转基因玉米LY038、MON810和MON863，检测耗时仅11.195 min，具有高效、灵敏、快速等优点。周颖等[49]以CaMV35S启动子、hsp70intron1和Cry1A(b)基因为靶标，通过Multiplex PCR扩增，利用毛细管电泳检测PCR扩增产物，方法的检出限为0.05%。

3.5 Multiplex PCR-液相芯片技术在转基因成分检测中的应用

液相芯片技术 (Suspension array, liquid chip) 是一种芯片技术与流式细胞术相结合的新技术，是采用不同荧光编码的微球作为载体来实现核酸杂交反应以及配体-受体、酶-底物、抗原-抗体的结合反应，通过激光对荧光报告分子和编码微球进行检测，实现定性和定量分析[50]。与传统凝胶电泳相比，液相芯片鉴定技术具有更加突出优势，该技术将在医学诊断、农业检测、食品安全检测、环境监测等领域发挥巨大作用。

黄文胜等[51]以转基因水稻KF8、LL601、BT63、KF6、M12、KMD1、T2A-1、LL62和T1C-19为材料，建立了两个Multiplex PCR-液相芯片检测体系，方法的检测灵敏度达0.1%。付凯等[52]应用建立的Multiplex PCR-液相悬浮芯片技术检测了转基因玉米BT11、T25、GA21、MON863、BT176、MON88017、TC1507、MON810、BVLA430101、NK603、MIR162、MON89034和MIR604，方法的检测灵敏度达0.1%。

4 问题与对策

Multiplex PCR检测技术具有特异性好、灵敏度高、通量高、节省实验样品和试剂等诸多优点。但是与传统PCR相比Multiplex PCR更加复杂，一个扩增体系中多个PCR反应同时进行，如果各技术要素没有优化好以及影响因素控制不当的话，都可能导致特异性与灵敏度降低，甚至检测失败。虽然Multiplex PCR技术已经在转基因成分检测中进行应用，但是与转基因成分实际检测的需求相比，现有的Multiplex PCR技术仍然有很大的改善空间。主要包括如下几个方面需要改进：1)随着新技术的发展和新基因的引入，Multiplex PCR反应体系中引物对数量还需增加，最大提高检测通量。2)根据转基因成分检测实验室的管理要求对实验室进行功能区划分，严格按照检测流程操作，避免产生污染。3)为进一步将Multiplex PCR检测的灵敏性和特异性提高，缩短检测时间，除了优化改善与现有成熟技术的结合外，还需尽可能拓展Multiplex PCR与新技术的结合，各取所长，促进发展。4)随着检测设备和聚合酶的提升，Multiplex PCR反应体系、反应成分和反应条件还可进一步优化，提高检测效率。5)尽快将成熟稳定的Multiplex PCR检测技术标准化，规范指导转基因成分检测行为。