正交试验设计优化木瓜多糖提取工艺

李宝珠，苏诗蟠，王中来，胡育梅

(1.福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350116；2.泉州医学高等专科学校检验预防学院，福建泉州 362000；3.厦门伯赛基因转入技术有限公司，福建厦门 361002；4.福州大学至诚学院生物工程系，福建福州 350002)

木瓜多糖能够清除活性氧，如单线态氧、过氧化物、超氧化物、羟基自由基及过氧亚硝基[1]。而活性氧与癌症、心脏病及其他疾病有着重要的联系，可以作为一种潜在的药物制剂原材料。为了对木瓜多糖进行深入全面的研究，发挥其更多的价值，就必须先获得高纯度的木瓜多糖。因此，探究影响木瓜多糖得率的影响因素至关重要。

笔者将对木瓜多糖的提取影响因素进行初步研究。在木瓜多糖的常规法提取和含量测定的基础上对其进行了超声波辅助提取，用蒽酮-硫酸法[2-5]测定木瓜多糖的得率，采用L27(313)正交试验分析浸提温度、浸提时间、固液比和超声波处理时间这4个因素对多糖提取率的影响，同时考虑浸提温度与浸提时间、固液比、超声波处理时间的交互作用，采用方差分析的方法，确定其最佳工艺条件[6-10]。以期得出木瓜多糖提取的最佳工艺，为木瓜的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及预处理。将超市购买的新鲜海南木瓜洗净去皮去籽后，切成厚2～5 mm的片状果肉，置于恒温60 ℃的烘箱中烘干至恒重，经粉碎机粉碎后过40目筛，收集粉末，存储于干燥器中。精确称取1.00 g木瓜粉并按比例加入蒸馏水，经超声波处理10 min后在水浴锅中浸提一段时间。浸提液用高速离心机进行离心10 min，转速12 000 r/min，洗涤液和滤液并入，最后定容稀释，得到木瓜多糖的粗提取液。

1.1.2主要试剂与仪器。浓硫酸(分析纯)、蒽酮(分析纯)、无水葡萄糖(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；MILLI-Q超纯水机，美国MILLIPORE公司；电子天平，北京塞多利斯仪器系统有限公司；冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；多功能粉碎机，上海市浦恒信息科技有限公司。

1.2标准曲线的制作准确称取250 mg无水葡萄糖粉末加蒸馏水溶解后定容于500 mL容量瓶中，充分摇匀，制得浓度为0.5 mg/mL的标准葡萄糖溶液。分别移取1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00 mL标准葡萄糖溶液于50 mL容量瓶中，配制成浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mg/mL的葡萄糖溶液。分别移取2 mL不同浓度梯度的葡萄糖溶液至10 mL具塞试管中，同时置于冰浴中，每管分别加入4 mL浓度为2.00 mg/mL的蒽酮-硫酸溶液，加塞密封并摇匀。以蒸馏水作为对照组，每个浓度设置3个平行试验。将试验组与对照同时放入沸水浴中，当水温达到100 ℃时开始计时，10 min后取出，置于冰水中迅速冷却至室温，充分摇匀放置10 min，于波长625 nm处测定吸光值。测得的葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

1.3正交试验设计采用4因素3水平正交试验，考察超声波处理时间(A)、浸提时间(B)、固液比(C)和浸提温度(D)对木瓜多糖提取率的影响，同时考察因素之间可能的交互作用(AB、AC和AD)。选用L27(313)正交表进行正交试验，共有27组试验组合。各因素考察3个水平如表1所示。

表1木瓜多糖提取工艺正交试验因素水平设计

Table1Orthogonaltestfactorandleveldesignforpolysaccharideextractionofpapayafructuschaenomelislagenariae

水平Level因素Factor超声时间Ultrasonictime(A)min浸提时间Extractiontime(B)∥min固液比Solid-liquidratio(C)mg/mL浸提温度Extractiontemperature(D)∥℃120301∶3060230601∶4070340901∶5080

2 结果与分析

根据正交表安排试验，同时留取3列空白，作为误差估计。按正交表实施试验，共27个组合，获取各组合的提取率。正交试验安排和木瓜多糖提取率见表2。

对试验结果进行方差分析，考察各个因素对木瓜多糖提取率的影响。方差分析结果显示，FA=9.36**，FB=5.54*，FAB=6.45**,FC=4.14*,FAD=9.89**,F0.05(2,12)=3.89,F0.01(2,12)=6.93,F0.05(4,12)=3.26,F0.01(4,12)=5.41。由方差分析中的显著性可得到，AD、A和AB在0.01水平上高度显著，B和C在0.05水平上显著，而AC对指标的影响不显著，可忽略不计，并入误差。虽然浸提温度(D)不显著，但是其与超声波处理时间(A)的交互作用是显著的，所以该因素不能忽略。因此，超声波处理时间(A)、浸提时间(B)、固液比(C)和浸提温度(D)，在0.05水平对木瓜多糖提取率均有影响。

木瓜多糖的提取率越高越有利，即目标遵循望大准则[11-12]。因此，可根据各因素与交互作用的指标和，确定最优工艺条件组合，见表3。

根据各因素的指标和，初选优水平：由表3可知，根据A、B、C和D 3个因素的最大指标和，其初选优水平分别为A3、B3、C1和D3。因素和交互作用的主次顺序：由方差分析可知，根据F值大小，因素和交互作用的主次顺序依次为AD、A、AB、B、C 。

表2 木瓜多糖提取的正交试验

表3 因素与交互作用的指标和

根据交互作用的指标和，以及因素和交互作用的主次顺序，确定优水平。由表3可知，AD的优水平为3，又因AD在主次顺序中排第1位，因此A和D应该取A3和D3，显然与上文中初选出的优水平相吻合。

由表3可知，AB的优水平为2，又因AB在主次顺序中排在B之前，因此B的优水平应该由AB决定，取B2。显然优于上文中初选出的优水平B3，因为此时平均指标和大于表3中B3的最大指标和。

因素C的优水平：因素C为不显著因素，从节能角度考虑，应该取最小固液比，即C1。此时，正好与表3中的最大指标和水平相一致。

综上所述，最优水平组合为A3B2C1D3，即最优工艺条件为超声波处理时间40 min、浸提时间60 min、固液比1∶30 mg/mL和浸提温度80 ℃。最后，在最佳条件A3B2C1D3下，进行3次重复试验，测定多糖得率为15.2%。

3 结论

通过考虑交互作用并设计使用L27(313)正交表的4因素3水平正交试验，确定木瓜多糖提取的最优工艺条件为超声波处理时间40 min、浸提时间60 min、固液比1∶30 mg/mL和浸提温度80 ℃。最后，在此最佳条件下进行3次重复试验，测定多糖得率为15.2%。

该研究采用L27(313)正交试验设计，并考虑因素间的交互作用，确定木瓜多糖提取的最优工艺条件，为木瓜多糖的开发利用提供技术指导。后期可以进一步研究，采用响应面试验方法，找出各个因素的操作空间，将更有利于工业化开发。

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