烟草胞质雄性不育系与保持系内源植物激素水平差异性研究

陈建国，王建波，胡如忠，陈钊德，杨振智，丁 丁，郭大芳，谢晋云，安开宇，朱列书，彭 妙

(1.毕节市烟草公司金沙县分公司，贵州毕节 551800；2.贵州省烟草公司质检站，贵州贵阳 550081；3.湖南农业大学农学院，湖南长沙 410128；4.湖南农业大学生物科技学院，湖南长沙 410128)

植物的雄性不育现象通常是指产生的花粉没有正常的生活力，雄性不育的表现形式有多种，如雄蕊的畸形或缺失，花药无法正常开裂，无法形成花粉等。一般烟草雄性不育的表现形式为雄蕊的缺失。烟草雄性不育多为细胞质雄性不育类型。烟草从形成雄蕊原基到形成成熟具有生活力的花粉，在此过程中要经历一系列的生理生化与形态特征等各个方面的变化。对于植物来说这是一个复杂的过程，在此过程中出现任何影响，不管是内因或外因，植株都不能形成正常的花粉，从而导致雄性不育。植物雄性不育性状是植物杂种优势利用的重要工具，具有巨大的生产利用价值。烟草的胞质不育现象在烟草的育种应用方面有着重要的意义。

烟草雄性胞质雄性不育系的形成过程，包括一系列的物质和能量代谢，涉及各种复杂的生理生化反应，对烟草胞质雄性不育系及其相应保持系的生化指标进行比较研究，有助于了解烟草胞质雄性不育系发生机制和有关代谢过程。物质代谢是植物生命活动的基础，植株间的生理生化差异，必然反映在物质代谢的差异上，而植物对物质和能量的代谢和生长发育均要通过体内的内源激素的调节来实现。鉴于此，笔者研究了烟草包质雄性不育系与其保持系生长期内源植物激素含量的变化规律和激素水平差异，为更好地应用烟草的雄性不育现象提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料以烟草雄性不育系及其保持系为供试材料，共设3个处理，即MSK326与K326(处理①)、MSK394与K394(处理②)、MS云烟87与云烟87(处理③)。

1.2试验方法采用大田试验，前茬作物为水稻，土壤肥力均匀，地势平坦，有较好的灌溉条件。采用漂浮育苗的方式。株行距50 cm×120 cm种植。试验设3次重复，四周设保护行。基肥中氮肥全部为硝基磷酸铵，磷肥为普钙，钾肥为硫酸钾，硝酸钾用于追肥，基肥∶追肥=60∶40，追肥分2次施用，其他田间管理同当地优质烟叶开发生产技术规范。分别在苗期、团棵期与旺长后10 d、现蕾期和中心花开放期取样，每个小区选取5株有代表性的高频样品，苗期取整株幼苗的地上部分，团棵期与旺长后10 d用直径为1.5 cm的打孔器取烟株所有功能叶片(需烟样20.0 g)，现蕾期和中心花开放期取花蕾和所有功能叶片。用超纯水洗净，滤纸吸干，立即放入-80 ℃冰箱保存待测。

1.3内源激素的提取、纯化、测定样品的提取、纯化和检测参考王若仲等[1]的方法进行。称取20.0 g新鲜烟样，迅速放入液氮处理2～3 min，遮光条件下将样品进行真空冷冻干燥。称取冻干样品0.50 g左右(精确至0.000 1 g)，样品中加入预冷的提取液甲醇∶水∶乙酸(V∶V∶V=15∶4∶1)8 mL，摇匀，-20 ℃避光浸提。将过夜浸提的样品4 ℃低温离心20 min，取上清液。残渣中加入5 mL预冷的提取液再次提取，振荡离心20 min，2次重复，合并上清液，再进行真空冷冻离心，去甲醇，待溶液浓缩至3 mL，加入醋酸铵8 mL进行复溶，4 ℃高速离心，取上清液。上清液过SEP-C18小柱，过柱前，小柱先用5 mL甲醇活化，然后用5 mL 1 mol/L乙酸平衡固相萃取柱，平衡后上样，收集样品中内源激素，先后以6 mL 50%甲醇、5 mL 0.35 mol/L NH4OH的60%甲醇洗脱，合并洗脱液，真空冷冻离心浓缩至干。最后样品用500 μL的80%甲醇复溶后高速离心待测。

测定色谱条件如下：流动相为A(泵)0.27%三乙胺溶液，pH=3.0，B(泵)乙腈。流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，波长254 nm。用Zorbax SB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色谱柱按表1梯度洗脱。5种激素按照ZRs(反玉米素核苷)、GA(赤霉素)、iPAs(N6-异戊烯腺嘌呤)、IAA(吲哚乙酸)及ABA(脱落酸)的顺序出峰，设定高效液相色谱仪(Agilent 1290，美国)测定波长为254 nm，采用紫外可见检测器进行检测。

表1 梯度洗脱程序

1.4数据处理采用Excel软件进行测定值和平均值的计算。

2 结果与讨论

2.1不同时期烟草雄性不育系与其保持系内源激素含量变化由表2可知，苗期IAA的含量明显低于其他时期。保持系K326叶片中IAA的含量从苗期到中心花开放期逐渐升高，而K394与云烟87则逐渐下降。各不育系材料叶片中的IAA含量变化不大。K326叶片从苗期到中心花开放期的ABA含量有较明显的上升趋势，但其他处理没有明显的上升或下降的趋势。各处理在现蕾期和中心花开放期的叶片和花蕾中的ABA含量差别较大，花蕾中的ABA含量明显高于叶片。各不育系材料叶片中ZRs含量总体表现为先上升后下降的趋势，现蕾期叶片中ZRs含量最高。不育系与保持系苗期与团棵期ZRs含量均较低。花蕾中的ZRs含量也较低，不育系和保持系同一时期的叶与花蕾中，叶片的ZRs要明显高于花蕾。各处理不同生育期iPAs与GA含量无明显的规律性变化。

表2 烟草雄性不育系与保持系各时期内源激素含量差异的比较

2.2不同处理保持系与雄性不育系各时期IAA含量的比值比较从表3可以看出，苗期到中心花开放期叶片中保持系IAA的含量与不育系的比值均大于1，云烟87与MS云烟87在团棵期的IAA含量比达到2.53。各时期保持系与不育系的IAA含量比值变化差异不大。而在现蕾期与中心花开放期的花蕾中，保持系与不育系的IAA含量比值与其同一时期的叶片中IAA含量比值相反，保持系与不育系的IAA含量比值小于1。其中，云烟87与MS云烟87中心花开放期的花蕾中的IAA含量比值只有0.33。可以看出烟草保持系与其不育系从苗期到中心花开放期叶片中保持系的IAA 含量高于不育系，而在花蕾中不育系的IAA含量高于保持系。

表3 不同处理保持系与雄性不育系各时期IAA含量的比值比较

2.3不同处理保持系与雄性不育系各时期ABA含量的比值比较从表 4可以看出，除K394与MSK394中心花开放期叶片中ABA的值小于1外，其他材料保持系各时期部位的ABA含量与不育系的比值均大于1。现蕾期的花蕾中各保持系的ABA含量均是不育系ABA含量的2倍以上，其中K394现蕾期花蕾中的ABA含量是MSK394的5.18倍。各处理进入中心花开放期后，保持系与不育系的ABA比值缩小。烟草保持系与不育系在生长过程中，叶片和花蕾中的ABA含量保持系均要高于不育系。

表4 不同处理保持系与雄性不育系各时期ABA含量的比值比较

2.4不同处理保持系与雄性不育系各时期iPAs含量的比值比较由表5可看出，不同处理现蕾期和中心花开放期的花蕾中保持系与不育系iPAs的含量比均大于1，中心花开放期的花蕾中K326与MSK326、K394与MSK394的iPAs含量比值均大于10。除少数的几个时期外，不同处理叶片比值均小于1。在现蕾期与中心花开放期，烟草花蕾中的iPAs含量不育系比保持系低。

表5 不同处理保持系与雄性不育系各时期iPAs含量的比值比较

2.5不同处理保持系与雄性不育系各时期ZRs含量的比值比较从表6可以看出，保持系与不育系在苗期、旺长10 d、中心花开放期(叶)的ZRs比值均大于1。保持系与不育系在现蕾期花蕾中ZRs比值均小于1。中心花开放期的花蕾除云烟87与MS云烟87的比值大于1外，其他2个处理的比值小于1，因此可以看出在烟草花蕾中不育系的ZRs含量高于保持系。

表6 不同处理保持系与雄性不育系各时期ZRs含量的比值比较

2.6不同处理保持系与雄性不育系各时期ZRs+iPAs含量的比值比较表7表明，从苗期到中心花开放期的叶片中，3个处理保持系与雄性不育系各时期ZRs+iPAs含量的比值多数时期大于1，有时小于1。在现蕾期的花蕾中，除云烟87与MS云烟87的比值大于1外，另外2个处理小于1。在中心花开放时期的花蕾中，K326与MSK326的比值小于1，其他2个处理均大于1。

表7 不同处理保持系与雄性不育系各时期ZRs+iPAs含量的比值比较

2.7不同处理保持系与雄性不育系各时期GA含量的比值比较从表8可以看出，除K326/MSK326团棵期与K394/MSK394中心花开放期GA含量的比值小于1外，各处理其他时期保持系与不育系叶片中GA含量的比值均大于1。K326与MSK326现蕾期叶片中的GA比值最高，达2.73。K326与MSK326团棵期叶片中的GA比值最低，为0.73。花蕾中保持系与不育系GA含量的比值，K326与MSK326的比值均大于1，而K394与MSK394的比值均小于1，云烟87与MS云烟87的比值现蕾期小于1，而中心花开放期大于1。3个处理保持系与不育系在现蕾期花蕾中GA的比值，K326与MSK326的比值为1.01，其他2个处理小于1。中心花开放期的花蕾中，K394与MSK394的比值为0.95，其他2个处理大于1。

表8 不同处理保持系与雄性不育系各时期GA含量的比值比较

3 结论与讨论

采用高效液相色谱法测定了3个处理烟草不育系与保持系材料5种内源植物激素的含量，结果表明内源植物激素在不育系与保持系中有较大差异。

(1)保持系与不育系的IAA含量比值在各时期叶片中均大于1，而花蕾中小于1。在所测的生长期中，保持系叶片中的IAA水平均高于不育系，花蕾和叶片中则相反，不育系花蕾中表现为IAA的积累。但一般在植株中IAA含量高的部位是营养物质输入的“库”。大量研究表明，许多雄性不育植物种类都是由于IAA的亏缺导致营养物质的输入不足，花药的发育不良，从而导致雄性不育。如CMS玉米[2]、水稻[3]、柑橘[4]、榨菜[5]、小麦[6]等植物都有相同的研究结果，这些植物的不育系花药中的IAA水平明显低于可育植株。但也有些植物的研究结果相反，如番茄雄性不育突变体sl2以及GMS和CMS油菜的不育系雄蕊中生长素的含量高于相应可育系[7-8]，这表明生长素的积累也与雄性不育的发生相关联，这可能与生长素诱导乙烯产生有关，而乙烯是公认的杀雄剂。但在烟草雄性不育系花蕾中，IAA的积累和育性的表现是否与生长素诱导乙烯产生有关还要作进一步的研究。

(2)各生育期保持系和不育系的ABA含量比值在叶片和花蕾中均大于1。不育系与保持系在现蕾期ABA含量差别最大，现蕾期过后有缩小的趋势。当植物受到环境胁迫时，体内的ABA会急剧上升，ABA的积累与抗逆性的增强存在显著正相关[9]。烟草雄性不育系的ABA含量要明显低于保持系，而相应的烟草雄性不育系的抗逆性比保持系低。在生长发育的过程遇到复杂的环境，低水平的ABA可能导致不育系的抗逆性差，这可能是导致其雄性器官发育不良的原因之一。

(3)ZRs与iPAs都属于细胞分裂素类。细胞分裂素的主要生理效应是促进细胞的分裂。不同作物种类雄性的育性与细胞分裂素含量的关系不一致。如番茄[7]、榨菜[10]雄性不育株中细胞分裂素含量低于可育株；而CMS玉米[1]、辣椒[11]以及K、T型CMS小麦[6]的不育系花药组织或者花蕾与可育系相比，却表现为内源细胞分裂素类物质的积累。该试验测得数据显示，在烟草不育系与保持系的生长发育的过程中，叶片中的ZRs含量多表现为保持系高于不育系，而在花蕾中则表现为不育系低于保持系，在烟草不育系与保持系生长发育的过程中，叶和花蕾的ZRs含量表现出不同的规律。而iPAs则与ZRs大致呈相反的变化规律。在叶片中多数时期保持系要低于不育系，而在花蕾中则反之。iPAs在不育系烟株中的积累与ZRs在烟草不育系中的亏缺，特别是在花蕾中，可能与不育系植株的不育表现有关。

(4)不育系与保持系的GA含量比较显示，在生育期内

不育系GA含量表现出无规律的升高或降低，3个处理多数时期不育系GA含量低于保持系，低浓度的GA可能是与烟草的雄性不育有关，具体机制可作进一步的研究讨论。

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