纤维素酶解法提取剑麻总皂苷工艺研究

贾桂云，顾长瑜，李 云，刘 红，2*

(1.海南师范大学化学与化工学院，海南海口 571127；2.热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室，海南海口 571127)

剑麻(AgavesisaianaPerrine)，又名菠萝麻、西纱尔麻、剑麻麻，是剑麻科剑麻属植物，亚热带多年生草本硬质纤维作物，原产于墨西哥的龙加丹半岛。在我国广东、广西、福建、海南有大面积种植，主要用于生产剑麻纤维。剑麻叶片抽取纤维后的液汁中含有甾体骨架成分剑麻皂苷(Tigogenin)，甾体皂苷是天然产物中一类重要的化学成分，有降血糖、祛痰、止咳、抗炎、抗癌等多种生物活性，是半合成四大甾体激素药物的主要原料之一[1-2]。因此，从植物中提取天然甾体皂苷具有广阔的前景。目前，剑麻皂苷的提取多采用发酵方法，破除坚厚的植物细胞壁，让依附在纤维素中的剑麻皂苷释放出来，该方法原料、试剂消耗较多，且产生大量的酸碱废水。近年来，超声辅助提取剑麻总皂苷的工艺和超临界CO2萃取剑麻中总皂苷的工艺也有报道[4-7]。采用纤维素酶解法-乙醇浸提法[8]，即用纤维素酶分解剑麻植物的坚硬细胞壁，用乙醇提取剑麻总皂苷，探讨最佳提取工艺，为纤维素酶解法提取剑麻的皂苷类化学成分提供参考。

1 材料与方法

1.1仪器ZN-04A小型粉碎机(北京兴时利和科技发展有限公司)；TP-214电子天平(丹佛仪器(北京)有限公司)；RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；i5紫外可见分光光度计(济南海能仪器股份有限公司)；SB-5200DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)；HH-1数显恒温水浴箱(金坛市金南仪器制造有限公司)；数显酸度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

1.2材料与试剂剑麻采摘于海南师范大学桂林洋校区。洗净、阴干后放在干燥箱内37 ℃干燥后粉碎。

纤维素酶[安倍医疗器械贸易(上海)有限公司(MP Biomedicals)]；熊果酸[阿拉丁试剂(上海)有限公司]；乙醇、甲醇、冰乙酸、香草醛、高氯酸等均为国产分析纯；蒸馏水(实验室自制)。

1.3方法

1.3.1剑麻总皂苷的提取。准确称取剑麻的样品粉末0.500 0 g至50 mL的圆底烧瓶中，按一定的固液比加入蒸馏水，调节pH，加入纤维素酶，使酶的质量浓度达到控制值。将圆底烧瓶置于水浴锅中，在一定温度下酶解反应，反应结束后，移入80 ℃的恒温水浴锅中灭活30 min。离心分离酶解液，上层清液留用，下层的沉淀物用15 mL 95%乙醇在70 ℃恒温水浴回流浸提60 min后抽滤，滤液与酶解液合并，减压蒸干。移至100 mL容量瓶用甲醇溶解定容，即为提取物的样品溶液。

1.3.2纤维素酶解法提取单因素试验。影响纤维素酶解反应的主要因素包括酶质量浓度、酶解温度、pH、酶解时间及固液比等因素，针对其中一个因素，在保持其他因素相同的条件下进行单因素试验，考察单因素对剑麻总皂苷提取率的影响。

1.3.3纤维素酶解法提取正交试验。选取单因素试验中对总皂苷提取率影响较大的因素进行正交试验，按照因素水平表设计，考察各因素对剑麻总皂苷的影响程度，优选最佳工艺条件。

1.3.4工作曲线的绘制。准确称取熊果酸对照品0.010 0 g于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度(200 μg/mL)，摇匀。精确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL溶液分别置于7支磨口的具塞试管中，水浴挥干无水乙醇后加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，塞紧试管磨口塞，混匀。在70 ℃水浴中加热15 min使显色反应完全，冰水冷却10 min。加冰乙酸4 mL摇匀，随行试剂作空白。在545 nm测定吸光度[8]。熊果酸对照品加入量为x坐标，吸光度为y坐标，线性回归，得线性回归方程y=0.002 19x+0.000 91，R=0.998 16，线性范围0～240 μg。

1.3.5剑麻总皂苷含量的测定。准确吸取提取物的样品溶液0.2 mL于具塞磨口试管中，按“1.3.4”中显色方法操作，在545 nm测样品吸光度，计算提取率。

式中，C为样品溶液中总皂苷浓度(mg/mL)，V为样品溶液的总体积(mL)；W为剑麻粉末的质量(mg)。

2 结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1酶的质量浓度对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻叶粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比为1∶20，pH 5.0，水浴酶解温度为50 ℃，酶解时间为100 min，纤维素酶质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，酶的质量浓度对剑麻总皂苷提取率的影响见图1。

图1 酶的质量浓度对提取率的影响Fig.1 Effects of concentration of cellulase on extraction rate

当纤维素酶质量浓度在0.15～0.20 mg/mL，总皂苷的提取率达到最大值，酶浓度超过0.20 mg/mL剑麻总皂苷的提取率反而呈现下降趋势，原因可能是体系中过量的酶没有机会与底物反应，反而影响总皂苷提取。

2.1.2酶解温度对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比为1∶20，pH 5.0，酶质量浓度为0.15 mg/mL，酶解时间为100 min，分别在40、45、50、55、60 ℃恒温水浴酶解，酶解温度对剑麻总皂苷提取率的影响见图2。

图2 酶解温度对提取率的影响Fig.2 Effects of temperature of enzymatic hydrolysis on extraction rate

随酶解温度的提高，剑麻皂苷提取率增加，50 ℃时达到最高，继续提高酶解温度，提取率下降。其原因是温度超过50 ℃纤维素酶活性下降，细胞壁没有被完全分解，影响剑麻皂苷的浸出。最适宜的酶解温度是50 ℃。

2.1.3溶液pH对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻叶粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比1∶20，水浴酶解温度为50 ℃，纤维素酶质量浓度为0.15 mg/mL，水浴酶解时间为100 min，调节溶液pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶解pH对剑麻总皂苷提取率的影响见图3。

图3 提取液pH对提取率的影响Fig.3 Effects of pH on extraction rate

试验结果显示，溶液的pH对总皂苷提取率影响很大。当溶液pH在4.0～5.0时，总皂苷的提取率随着pH的升高而增加，在溶液pH为5.0时，总皂苷的提取率达到最大值。继续增加溶液的pH，总皂苷的提取率开始下降。可见最佳溶液pH为5.0。

2.1.4酶解时间对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻粉末于50 mL圆底烧瓶中，在固液比为1∶20，pH 5.0，纤维素酶质量浓度为0.15 mg/mL，50 ℃恒温水浴酶解，酶解时间分别为30、60、90、120、150 min，纤维素酶酶解反应时间对剑麻总皂苷提取率的影响见图4。

图4 酶解时间对提取率的影响 Fig.4 Effects of time of enzymatic hydrolysis on extraction rate

随着酶解时间的增加，剑麻总皂苷提取率在增加，超过120 min时，提取率下降，这与黄山等[9]酶解法提取绞股蓝总皂苷的结果吻合。可能是随着酶解时间的增加，酶解液糊化，影响剑麻总皂苷提取。最佳酶解时间为90～120 min。

2.1.5固液比对提取率的影响。准确称取0.500 0 g剑麻叶粉末于50 mL圆底烧瓶中，在溶液的pH为5.0，水浴酶解温度为50 ℃，纤维素酶质量浓度为0.15 mg/mL，水浴酶解时间为100 min，固液比分别为1∶18、1∶20、1∶22、1∶24、1∶26，按“1.3.2”项下方法制备样品溶液，固液比对剑麻总皂苷提取率的影响见图5。

图5 固液比对提取率的影响Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate

固液比在1∶18～1∶26对总皂苷提取率的影响较为平缓，考虑节省试剂及减少后续浓缩的能耗、工作量等因素，选取固液比1∶20。

2.2正交试验优化提取工艺为考察各个因素对总皂苷提取率的交互作用，选取单因素试验中对总皂苷提取率影响较大的酶质量浓度、酶解温度、酶解时间、酶解pH 4个因素进行考察，每个因素设3个水平，采用L9(34)正交设计表，正交试验的因素水平见表1，正交试验的结果见表2。

表1 正交试验因素与水平

表2 正交试验结果

正交试验结果显示，在选定的因素水平中，影响程度依次为：D>B>C>A，即酶解液pH>酶解温度 >酶解时间>酶质量浓度，极差分析中最佳提取工艺是A2B1C1D3，即酶质量浓度为0.18 mg/mL，酶解温度为45 ℃，pH 5.5，酶解时间为100 min，料液比1∶20。该条件在正交试验中没有出现，需验证。

方差分析表明，酶解液的pH、酶解温度对剑麻总皂苷的提取率影响极显著，酶解时间影响显著，酶质量浓度在选定的水平范围内影响不显著。

2.3最佳工艺条件下验证试验为确定最佳提取工艺的稳定性，在A2B1C1D3下平行做3次验证试验，提取率分别为19.21%、18.95%和19.45%，平均提取率19.20%。相对标准偏差RSD1.8%。

2.4加样回收率精密度为进一步验证方法的精密度，进行加标回收试验。分别吸取10、20、30、40、50 μL已知浓度的样品溶液，再加入0.1 mL熊果酸标准溶液，按标准曲线项下的方法测定其吸光度，并计算总皂苷浓度，以计算其回收率和回收率的相对标准偏差。结果见表3。

表3 加样回收率精密度

由表3可见，加标平均回收率为91.1%，相对标准偏差RSD为1.52%，因此可保证用该方法处理样品的误差小，试验可靠性高。

3 讨论

植物中的总皂苷等分布在植物的细胞壁内，细胞壁主要由纤维素构成。利用酶解反应的高效、专一性，选择纤维素酶解反应破坏细胞壁，以便提取皂苷类成分。剑麻总皂苷中含有多种甾体皂苷[10-11]，甾体皂苷极性大，因此，破壁后的酶解物用95%乙醇提取。提取物总皂苷测定时利用甾体皂苷在无水条件下，遇某些酸类可产生与三萜皂苷相类似的颜色反应，故用五环三萜类的熊果酸标准品作标准对照品，选用显色灵敏的香草醛-高氯酸反应，进行显色。因为要求无水条件下，所以选择极性比无水乙醇大的甲醇定容。

选取对酶解反应影响较大的酶解时间、酶解温度、酶的质量浓度、固液比、溶液的pH进行单因素试验，结果显示，除固液比外，其他4个因素对提取率的影响较大，固液比的影响较为平缓，因此，选固液比1∶20。正交试验极差分析及方差分析结果显示，对剑麻总皂苷提取率的影响顺序为酶解液pH>酶解温度 >酶解时间>酶质量浓度，酶解液的pH、酶解温度对剑麻总皂苷的提取率影响极显著，酶解时间影响显著，酶质量浓度在选定的水平范围内影响不显著。这与文献[12]的研究相吻合。

在优选出的最佳提取工艺下A2B1C1D3，即酶质量浓度为0.18 mg/mL，酶解温度为45 ℃，pH 5.5，酶解时间为100 min，料液比1∶20，验证试验剑麻总皂苷的平均提取率为19.20%。加标回收率显示，平均回收率在91.1%，RSD为1.52%，说明该方法比较准确，可用于皂苷类成分提取的检测。

纤维素酶解法提取剑麻总皂苷，绿色环保，可为纤维素酶解法提取剑麻总皂苷的工业化提供参考。

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