利用Caco-2细胞模型研究新型Pim-1激酶抑制剂KY-C002的表观渗透系数

马 雁，徐绍辉，于坤宏，郭圣荣

原癌基因Pim-1是基因pim家族(现发现pim-1、pim-2、pim-3)中的一员，Pim-1激酶在调控细胞凋亡、分化、增殖以及肿瘤形成等方面发挥非常重要的作用。Pim-1蛋白作为新的抗肿瘤靶点，具有较高的选择性，近年来越来越被关注[1-4]。化合物KY-C002(结构见图1)是杂芳基酰胺类化合物。Ge[5]首先合成并证实该化合物是一种优良的Pim-1激酶抑制剂，可用于预防和治疗癌症、自身免疫疾病、过敏反应等疾病，具有很好的临床应用价值。目前尚未有关于其生物药剂学性质的研究报道，对于其生物药剂学性质的研究是十分必要的。Caco-2细胞系来源于人类结肠癌细胞，在常规的细胞培养条件下，即可自发分化形成肠上皮细胞样的细胞，广泛应用于小分子药物口服吸收的体外筛选模型[6-8]。该文采用Caco-2细胞单层模型研究Pim-1激酶抑制剂KY-C002的表观渗透系数及药物浓度的影响，为进一步开展Pim-1激酶抑制剂KY-C002的动物在体肠吸收以及开发其口服制剂提供有价值的参考。

图1 KY-C002的分子结构图

1 材料与方法

1.1主要仪器高效液相色谱仪购自美国Waters 公司；BSA124S万分之一电子天平购自北京赛多利斯科学仪器有限公司；KQ5200型超声清洗仪购自昆山市超声仪器有限公司；MQS-30电热恒温水浴摇床购自上海市旻泉仪器有限公司；85-2型磁力搅拌器购自上海司乐仪器有限公司；L500型离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HF151UV CO2培养箱购自香港力康生物医疗科技控股集团；JB-CJ-IFX超净工作台购自吴江市万里彩钢净化有限公司；XSP-37XBW型倒置显微镜购自上海光学仪器六厂；Millicell-ERS-2型细胞电阻仪购自美国Millipore公司；Multiskan MK3 酶标仪购自芬兰Thermo Labsystems 公司。

1.2主要试剂与细胞化合物KY-C002(自制)；乙腈(色谱纯，批号：0000077519)购自美国J.T Baker公司；三氟乙酸(分析纯，批号：STBF6924V)购自 美国Sigma公司； 24孔聚碳酸酯膜转运板和25 cm2细胞培养瓶购自美国 Corning costar 公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Caco-2细胞株购自中科院细胞库。

1.3KY-C002含量分析的高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)的建立

1.3.1色谱条件 色谱柱： C18柱(4.6 mm×250 mm，粒径5 μm)；波长301 nm；流速1 ml/min；流动相：A相为0.1%三氟乙酸水溶液，B相为0.1%三氟乙酸乙腈溶液；0～ 8 min A相：95%～5%，B相：5%～95%； 8～10 min A相：5%，B相：95%相；10～12 min B相：100%。

1.3.2HPLC方法的建立 从系统适用性、专属性、重复性、准确度、线性等方面验证HPLC方法。

1.3.3溶液稳定性 置于2～8 ℃、室温和37 ℃条件下考察对照品溶液的稳定性。

1.4Caco-2细胞单层膜模型的建立和评价[9-11]

1.4.1细胞培养 细胞培养和种板：复苏冻存的Caco-2细胞，加入10 ml完全 DMEM-10 培养液，将得到的细胞悬浮液转移至25 cm2细胞培养瓶中，放入5% CO237 ℃恒温培养箱中培养，隔天换液，当细胞达到约80%汇合时进行传代。细胞培养至合适状态时进行种板，细胞接种到24孔Transwell板，接种密度6×104个/ml 。向Transwell板的单层膜基底端(basolateral side, BL 侧)加入0.3 ml 完全 DMEM-10 培养液(无细胞)，向孔板单层膜顶端(apical side, AP 侧)加入0.2 ml已经充分混合的细胞悬液。2 d换AP侧和BL端侧； 3～7 d隔天换AP侧和BL侧液； 8～17 d每天AP侧换液，隔天BL侧换液； 18 d以后每天换AP侧和BL侧液。

1.4.2细胞单层模型评价

既然如此，对于人工智能，我们是否也可作如是观？进一步说，特别是当人工智能发展到“类人”阶段之时，其和人类的不同究竟还有多大？这种不同，是否必定比女性和男性的不同更大？如果我们不应因女性和男性的差异而否认女性的法律人格，那至少在逻辑上说，差异也不能成为否认人工智能之法律人格的理由。

1.4.2.1显微镜观察Caco-2细胞形态 Caco-2细胞在培养至20 d左右，显微镜下观察细胞生长情况，观察细胞生长是否均匀，是否可以清楚地看见细胞之间的接触，以此判断细胞是否形成完整的细胞单层。

1.4.2.2测量Caco-2细胞单层膜跨膜电阻 将Millicell-ERS电阻仪电极放入 PBS(pH 7.2)内平衡 24 h，然后置于与培养液类似的无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡盐溶液内平衡2 h。平衡后将电极置于 70%乙醇浸泡 15 min，再在空气中干燥15 s后放入无菌无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡盐溶液液中浸泡 15 min，打开电源，校正电压与电阻，测量空白对照 Millicell 膜的跨膜电阻值，然后测Caco-2 细胞单层膜跨膜电阻值，样品的实际电阻为样品实测电阻减去空白电阻值。

1.4.2.3酚红通透性实验 取电阻值≥ 250 Ω/cm2的 Caco-2 细胞单层膜[12]，用无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡盐溶液小心冲洗3次，轻轻吸干孔内无Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡盐溶液，以清除细胞表面对测定有干扰的物质。于 Caco-2 细胞AP侧加入含5 mg/L酚红的无Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡盐溶液(pH 7.2) 300 μl，细胞BL 侧加入不含酚红的无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡盐溶液400 μl。将培养板置37 ℃、5% CO2培养箱内，于 30、60、90、120 min 于 BL 侧取样 200 μl，并加入 200 μl 不含酚红的无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡盐溶液。以酶联免疫荧光分析仪于560 nm处测定 Caco-2 细胞单层膜BL侧内酚红的累积透过量。 计算表观渗透系数(apparent permeability coefficient Papp)，Papp=(dQ/dt)/(AC0)，其中 dQ/dt 为单位时间药物转运量(mg/s)；A为转运膜的面积，此时A为0.6 cm2；C0为酚红的初始浓度5 mg/ml。

1.5化合物KY-C002转运实验将化合物KY-C002溶解在纯水中配制成100 μg/ml储备液，以无Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡盐溶液稀释至所设计浓度。选取细胞跨膜电阻≥250 Ω/cm2的Caco-2细胞单层，根据实验设计，分别在细胞两侧加入化合物KY-C002溶液和无Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡盐溶液(AP侧0.3 ml，BL侧0.4 ml)，与恒温摇床上(37 ℃, 50 r/min)温育。化合物溶液的浓度分别为5、10、20 μg/ml。再按实验设计时间点进行取样，单孔取点，每点平行3个孔。取得的样品溶液过滤之后按照“KY-C002含量分析的HPLC方法”测定转运量，计算Papp和BL→AP 侧跨膜转运的表观系数与AP→BL 侧跨膜转运的表观系数的比值外排率(efflux ratio，ER)值。

2 结果

2.1建立KY-C002含量分析的HPLC方法本文中建立的HPLC方法适用于新型Pim-1激酶抑制剂KY-C002含量分析。具体结果如下。

2.1.1系统适用性 KY-C002：两份对照品溶液各连续进样3针，响应因子的RSD均为0.2%，均≤3.0%；两份对照品溶液3针响应因子平均值之比为99.3%，在97.0%～103.0%。酚红：两份对照品溶液各连续进样3针，响应因子的RSD分别为0.4%、0.1%，均≤2.0%；两份对照品溶液3针响应因子平均值之比为100.2%，在97.0%～103.0%。

2.1.3重复性 KY-C002：平行配制6份供试品溶液含量的为99.7%，RSD为1.3%，≤3.0%。酚红：平行配制6份供试品溶液含量的为99.2%，RSD为1.0%，≤3.0%。

2.1.4准确度 KY-C002：40%浓度的回收率分别为101.5%、103.9%、99.9%；100%浓度的回收率分别为96.7%、100.2%、100.7%；200%浓度的回收率分别为100.5%、101.8%、101.6%；在95.0%～105.0%。酚红：40%浓度的回收率分别为98.1%、98.0%、98.4%；100%浓度的回收率分别为99.3%、99.0%、97.6%；200%浓度的回收率分别为99.6%、99.3%、99.7%；在95.0%～105.0%。

2.1.5线性 KY-C002：对照品溶液在0.21～21.06 μg/ml范围内线性良好，线性方程为Y=47 690.597 1X-4 934.153 2，R=0.999 8，响应因子的RSD%为1.9%。酚红：对照品溶液在0.41～40.58 μg/ml范围内线性良好，线性方程为Y=15 036.130 7X-174.708 8，R=1.000 0，响应因子的RSD%为0.8%。

2.1.6溶液稳定性 样品溶液保存在2～8 ℃条件下，至少1 d内保持稳定；对照品溶液保存在2～8 ℃条件下，至少1 d内保持稳定。

2.1.7化合物KY-C002的色谱行为图 见图2。

2.2Caco-2细胞单层膜模型的评价本实验室条件下建立的Caco-2 细胞单层膜模型可用于化合物KY-C002的跨膜转运实验。

2.2.1显微镜观察Caco-2细胞形态 Caco-2细胞在24孔Transwell板上培养21 d左右，显微镜下观察细胞生长情况，细胞生长均匀，在细胞之间形成接触清晰可见的边界线，其形态见图3。

2.2.2Caco-2细胞单层膜跨膜电阻 本实验中细胞培养至19 d、20 d进行电阻测定，连续两天电阻值为(455 ± 40)Ω/cm2，均>250 Ω/cm2。

图2 化合物KY-C002的HPLC色谱图

注：tR=7.87 min；右侧峰为KY-C002，左侧为酚红；A：空白溶剂色谱行为图；B：KY-C002对照品色谱行为图；C：细胞样品色谱行为图

图3 培养20 d显微镜下Caco-2细胞形态 ×40

2.2.3酚红通透性实验 取酚红标准试液5 mg/L 加入到24孔板的Millicell 膜中，于不同时间取样(Millicell膜接收池)，酶标仪测定其吸光度值，通过酚红标准曲线计算酚红透过量，计算Papp。酚红在 Caco-2 细胞单层膜的Papp均<10-6cm/s，远低于没有培养细胞的空白组，说明酚红从 AP 侧渗漏入 BL 侧较少，膜的完整性良好。在实验中，也可用肉眼与空白对照观察有无酚红。 见表 1。

表1 酚红透过试验不同时间的 Papp(cm/s)

2.3化合物KY-C002转运实验不同浓度Pim-1激酶抑制剂KY-C002的Papp、ER结果见图4、表2。结果表明：① 在考察的浓度范围内，无论从AP侧到BL侧，还是从BL侧到AP侧Papp均与Pim-1激酶抑制剂KY-C002的浓度有关，不同浓度间差异有统计学意义(P<0.05)；浓度为10 μg/ml时的Papp大于5 μg/ml和20 μg/ml时的Papp。② 在考察的浓度范围内，从AP侧到BL侧Pim-1激酶抑制剂KY-C002的Papp均>10-6cm/s，表明该化合物吸收良好。

图4 不同浓度Pim-1激酶抑制剂KY-C002的Papp

A：AP侧→BL侧；B：BL侧→AP侧；与5 μg/ml KY-C002比较：*P<0.05；与10 μg/ml KY-C-002比较：#P<0.05

表2 Pim-1激酶抑制剂KY-C002的Papp (n=3,±s)

3 讨论

本研究建立了新型Pim-1激酶抑制剂KY-C002 的HPLC色谱检测方法且完成方法学验证，结果表明该方法简便、灵敏、可靠、专属性良好，符合定量分析要求。

评估药物口服吸收效果的常用方法是整体动物实验，而用细胞模型进行体外吸收特性评估具有以下优点[13]：① 避免动物的个体差异，体外重现性好；② 克服整体动物吸收代谢耗药量大的缺点，尤其适于对微量样品的检测；③ 检测周期较短，可作为快速药物筛选工具；④ 可以在分子水平对药物分子的吸收、代谢和转运进行研究。一般来说，连续2 d测得的电阻值> 250 Ω/cm2的 Caco-2 细胞单层膜可用于化合物的跨膜转运实验[14]，本实验室条件下建立的Caco-2细胞模型适用于化合物的转运实验。

综上所述，在考察浓度范围内，新型Pim-1激酶抑制剂KY-C002的Papp与浓度有关，化合物KY-C002的Papp>10-6cm/s，表明该化合物的吸收良好[14]，具有开发口服给药剂型的可能性，为进一步开展动物体内肠吸收实验提供了参考和基础。

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