生牛乳中金黄色葡萄球菌的耐药性研究

苑学霞 苏梅 邬元娟 王文博 张从超 李瑞菊 李鸳鸯

摘要：为调查山东省生牛乳中金黄色葡萄球菌的耐药性情况，本研究采集山东省6个不同地区的130份生牛乳样品，进行金黄色葡萄球菌的分离、鉴定及耐药表型分析。结果表明，共有57份样品判定检出金黄色葡萄球菌，平均检出率为43.85%。对57份样品进行8大类12种抗生素的药敏试验，结果表明对青霉素的耐药率最高，为87.72%，同时对氨苄西林、红霉素和克林霉素的耐药率也达到较高水平，分别为84.21%、78.95%和56.14%。另外，57株金黄色葡萄球菌中有50株为多重耐药菌株，其中以耐3种药物与耐5种药物的菌株数最多，且耐药谱种类较多，受地区差异影响较大。该结果可为山东地区奶牛业规范使用抗生素提供一定参考。

关键词：生牛乳；金黄色葡萄球菌；耐药性

中图分类号：S823.9+1：R155.5+7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0117-04

Abstract In order to investigate the drug resistance of Staphylococcus aureus in raw cow milk， 130 samples of raw milk from 6 different areas of Shandong Province were collected for the isolation， identification and phenotypic analysis of S. aureus. The results showed that S. aureus were detected in 57 samples， and the average detection rate was 43.85%. The susceptibility test of 57 samples to 12 kinds of antibiotics belonged to 8 classes showed that the resistance rate to penicillin was the highest of 87.72%， and the resistance rates to ampicillin， erythromycin and clindamycin reached higher level， which were 84.21%， 78.95% and 56.14% respectively. In addition， 50 strains showed multiple drug resistance， and the strains resistant to three and five drugs were the most，and the drug multi-resistant patterns were various and different from areas. The results could provide references for the standard use of antibiotics in dairy industry in Shandong Province.

Keywords Raw cow milk； Staphylococcus aureus； Drug resistance

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是当今世界三大食源性致病菌种之一，在空气、土壤、健康的动物和人及其粪便中广泛存在[1]。金黄色葡萄球菌在适当条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。如果长期食用含有抗生素残留的牛乳或乳制品，相当于长期低剂量的摄入抗生素，会使人体肠道内的正常菌群受到抑制，从而引起致病菌大量繁殖使得局部或全身感染[2]。金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原菌[3]，抗生素的濫用导致耐药性金黄色葡萄球菌的出现并泛滥[4]，重要的是其耐药性还可通过食物链传播[5]，这样便增加了多重耐药的危险，同时对人类健康造成直接威胁。

本研究从山东部分地区各大奶牛场采集130份生牛乳样品，利用生化方法与API试条同时鉴定样品中的金黄色葡萄球菌，采用微量肉汤稀释法进行抗生素药敏试验，以期为选择有效抗菌药，防止抗生素的滥用及研究致病菌提供可靠依据，为完善奶牛养殖业致病菌防治体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及样品来源

金黄色葡萄球菌参考株ATCC29213，来自中国菌种保藏中心，用于耐药性试验质量控制。130份生牛乳样品采自山东部分地区的奶牛养殖场收购站和生鲜乳运输车。

1.2 细菌培养基和主要试剂

7.5%氯化钠肉汤、营养琼脂、金黄色葡萄球菌生化鉴定试剂盒，均购自环凯（广东）微生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌显色培养基，购自科马嘉（法国）微生物科技有限公司；药敏试验所用药物购自天津金章科技发展有限公司。

1.3 金黄色葡萄球菌的分离鉴定

参照《GB 4789.10—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》方法[6]。用一次性无菌吸管或者大号移液枪吸取25 mL乳样，同时取225 mL无菌7.5%氯化钠肉汤，两者加入到均质袋中。将均质袋放入均质器上拍打1 min左右后，用移液枪吸取1 mL混合样品加入到金黄色葡萄球菌显色培养基中，涂布均匀，放入生化培养箱，37℃培养18 h，并设计空白对照。挑取显色平板中红色或粉红色、生长良好的单菌落接种于营养琼脂培养基中，放入生化培养箱，37℃培养18 h。挑取营养琼脂培养基中菌落接种于血平板中，同时进行血浆凝固酶试验，血平板中菌落呈金黄色或白色、周围可见完整透明溶血圈，血浆凝固酶试验结果为阳性，且镜检为革兰氏阳性球菌的结果判定为金黄色葡萄球菌；同时用API试条显色，结果经API LAB Plus 系统鉴定，确定是否为金黄色葡萄球菌。

1.4 耐药性检测

采用微量肉汤稀释法，试验方法及结果判定按美国临床实验室标准化委员会（CLSI）M31-A3进行[7]。对12种抗生素（头孢噻呋、苯唑西林、氨苄西林、青霉素、红霉素、四环素、环丙沙星、磺胺异恶唑、复方新诺明、万古霉素、替米考星、克林霉素）进行耐药性试验。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定

在血平板中有60份样品疑似为金黄色葡萄球菌，之后利用生化与API试条共同鉴定，结果发现，共有57份样品判定为金黄色葡萄球菌（表1）。API系统判定结果与生化鉴定结果一致。130份生鲜乳中，金黄色葡萄球菌的平均检出率为43.85%，运输车与收购站的检出率没有显著差别。

2.2 金黄色葡萄球菌的耐药率及耐药表型谱

2.2.1 金黄色葡萄球菌对12种抗生素的耐药率 表2显示，金黄色葡萄球菌对青霉素耐药率最高，为87.72%，对氨苄西林、红霉素和克林霉素的耐药率也达到较高水平，分别为84.21%、78.95%和56.14%，对头孢噻呋耐药率最低，为1.75%。其中，值得注意的是有7株金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药，由对苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌引起的感染已成为临床上较为棘手的问题[8]。

2.2.2 57株金黄色葡萄球菌的耐药表型谱 对3种或3种以上抗生素耐药的菌株判定为多重耐药菌株。本试验共有50株金黄色葡萄球菌具有多重耐药性（表3），其中以耐3种药物与耐5种药物的菌株数量最高，且耐药谱种类较多，受地区间差异影响较大。耐5种药物中的AMP-EM-PEN-TIL-CLI药谱菌株数量最多，共有8株。

3 讨论与结论

本研究从山東部分地区采集的130份生鲜牛乳样品，共分离到金黄色葡萄球菌57 株，平均检出率为43.85%，高于已有报道（重庆市24.67%[9]、内蒙古16.50%[10]）。这可能与当地养殖环境、卫生防疫、兽医兽药管理、采奶环境及日常饲养管理技术有关。

对8大类共12种抗生素进行药敏试验，结果表明山东部分地区生鲜乳中分离的金黄色葡萄球菌具有非常严重的耐药性，其中对青霉素的耐药率最高，为87.72%，对氨苄西林、红霉素和克林霉素的耐药率也达到较高水平，分别为84.21%、78.95%和56.14%。另外，57株金黄色葡萄球菌中有50株为多重耐药菌株，采集样品的6个地区均存在极高的多重耐药性现象，JA4地区多重耐药性为100%。整体而言，57株金黄色葡萄球菌共获得25种耐药表型谱，耐药谱广，主要是β-内酰胺类、磺胺类、四环素、氨基糖苷类、红霉素类等多种不同类型抗生素，其中耐5种药物中的AMP-EM-PEN-TIL-CLI药谱菌株数量最多。建议各养殖场暂停使用耐药率高的抗生素，根据耐药性结果适时调整抗生素使用方案，有针对性的选用药物。

总之，不同地区来源的菌株对抗生素的耐药趋势基本相同，但耐药种类差异明显。这是由于地区管理不同，养殖行业使用抗生素剂量超标和过于频繁所致[11]。多重耐药不仅增加了奶牛乳房炎的治疗难度和成本，也给牛奶消费者带来食品安全隐患，应引起奶牛养殖业和相关部门的高度重视。

参 考 文 献：

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