发根农杆菌菌株和花生品种对发根诱导率的影响

任艳 李双铃 尹亮 崔潇 李磊 石延茂 袁美

摘要：试验以花育20、花育45、鲁花11无菌花生子叶为材料，采用3×3双因子设计，研究3株发根农杆菌菌株和花生品种对花生发根诱导率的影响。结果表明：发根农杆菌和花生品种均显著影响发根诱导率。花育45的发根诱导率最高，为93.7%，其适宜菌株为A4；花育20的发根诱导率为89.2%，适宜菌株为ATCC15834；鲁花11的发根诱导率为73.4%，适宜菌株为GIM1.141。

关键词：发根农杆菌；发根；诱导率；花生品种

中图分类号：S565.2：S154.39文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0103-04

Abstract Three Agrobacterium rhizogenes strains on the induction rate of hairy roots of peanut were investigated by 3×3 double-factor design with the cotyledon of sterile plantlets of Huayu 20， Huayu 45， Luhua 11 as meterials. The results showed that both Agrobacterium rhizogenes and peanut varieties significantly affected the induction rate of hairy roots. Huayu 45 had the highest induction rate of 93.7%， and its appropriate strain was A4. The hairy roots induction rate of Huayu 20 was 89.2%， and the suitable strain was ATCC15834. The hairy roots induction rate of Luhua 11 was 73.4%， and its fitting strain was GIM1.141.

Keywords Agrobacterium rhizogenes； Hairy roots； Induction rate； Peanut varieties

發根是整个植株或植株的某一器官、组织（包括愈伤组织）单个细胞甚至原生质体受发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象[1]。发根农杆菌能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，并在感染部位产生大量生长迅速、多分支的发根[2]。发根的诱导是发根农杆菌Ri质粒上T-DNA基因转移到植物细胞并表达的结果[3]。发根起源于单个细胞，具有生长迅速、遗传稳定、有利于筛选高效表达克隆等特点[4]。发根转化体系的建立与发根农杆菌菌株有关，不同农杆菌的Ri质粒对不同植物、同一植物不同部位以及同一植物同一部位不同发育阶段的外植体有不同的敏感性；植物本身的基因型以及植物细胞受伤后的生理反应、细胞激素水平以及细胞壁结构等因素也和发根转化体系的建立有很大关系[5，6]。发根培养技术是基因工程和细胞工程相结合的一项技术[7]。

常用的发根农杆菌对花生外植体发根诱导能力存在差异，近年来有关花生发根的研究不少[8-14]，但不同发根农杆菌和花生基因型的组合并不多。本试验研究发根农杆菌菌株和花生品种对发根诱导率的影响，寻找菌株与品种的最佳组合，建立高效的发根转化体系，从而获得大量可在无激素培养基上旺盛生长且遗传稳定的发根，以期为建立花生发根培养北方根结线虫体系提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生品种：花育20、花育45、鲁花11，均由山东省花生研究所保存。

发根农杆菌：GIM1.141、ATCC15834、A4，其中GIM1.141购自广东微生物菌种保存中心，ATCC15834、A4均由陕西理工学院保存。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计及测定指标 采用3×3双因子完全随机试验设计，因子1为发根农杆菌菌株：GIM1.141、ATCC15834和A4；因子2为花生品种：花育20、花育45和鲁花11；每个处理30个外植体，重复3次。发根诱导率=产生发根的外植体数/外植体总数×100%。

1.2.2 无菌苗的获得 分别将3个花生品种的种子在70%乙醇中浸泡1 min，用无菌水清洗1次，然后用0.1%升汞浸泡10 min消毒，再用无菌水冲洗4～5次，每次4～5 min，之后接种在1/2MS0培养基上，于25℃、12 h光周期条件培养， 6～8 d后长出无菌苗。

1.2.3 发根农杆菌菌株的活化与培养 将超低温（-80℃）保存的3株发根农杆菌分别划线接种于含100 mg/L卡那霉素（Kan）的YEB固体培养基上，于28℃暗处培养，至长出单菌落。挑取平板上单菌落于10 mL含100 mg/L Kan的YEB液体培养基中， 28℃、黑暗下200 r/min摇床振荡培养约18 h，摇匀，取0.1 mL活化的菌液加入50 mL 含100 mg/L Kan的YEB液体培养基中进行二次活化，培养至农杆菌液A600值达到0.5～0.8，将菌液3 000 r/min离心3 min后弃上清，用50 mL MS0液体培养基悬浮，即获得侵染菌液。

1.2.4 外植体的转化及发根的诱导 在超净工作台上，将花生无菌苗的子叶切成0.3～0.5 cm小块，并在外植体表面轻划几处伤口，置于侵染菌液中浸泡10～15 min后取出，倒掉菌液，用无菌滤纸吸干多余菌液，接种于MS0培养基上，于黑暗条件下培养2 d，后转接到5MS0培养基〔含500 mg/L头孢霉素（Cephalosporin，简写Cel）〕上培养3～5 d，再转至3MS0抑菌培养基（含300 mg/L Cel）上培养。每7～8 d转接1次，30 d后统计诱导发根数并计算发根诱导率。

1.2.5 除菌篩选培养 将生长粗壮、约5～6 cm长的发根切下，放入筛选培养基（含30 mg/L Kan+300 mg/L Cel）中，7～8 d后选正常生长的根放入1MS0培养基（含100 mg/L Cel）上，每7～8 d转接1次，继代3次后转接至MS0培养基（不含抗生素）中培养。筛选生长快、长势好的发根，取该发根进行扩繁培养。

1.2.6 继代培养 待筛选出的发根培养20～30 d出现老化现象时，将长势较好、未出现老化的末端发根剪下，每段大于3 cm，转入新的MS0培养基（不含抗生素）中。

1.2.7 Ri质粒转化的判断 根据3项重要生物学特性初步判断Ri质粒转化情况：发根的发生多在母体植物的不定部位，发根表现为较弱的向地性，发根在无激素的培养基上能够正常快速地生长[15]。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.05对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 发根农杆菌对花生子叶的诱导培养

试验结果表明，3个品种花生子叶经发根农杆菌侵染后，微小的愈伤组织出现在子叶切口处，7～9 d后从切口处产生发根（图1A），发根多发生在母体植物的不定部位。3株发根农杆菌菌株均可诱导花育20、花育45、鲁花11的品种子叶外植体产生发根。发根切下后可在MS0培养基（不含抗生素）上独立生长（图1B），表现为较弱的向地性。15～20 d后发根布满整个培养皿（图1C），在无激素的培养基上能够正常快速地生长。从形态角度初步判断发根Ri质粒转化成功。

2.2 发根农杆菌菌株和花生品种对发根诱导率的影响

从表1可知，发根农杆菌菌株和花生品种都显著影响发根诱导率。不同花生品种平均发根诱导率为：花育45>花育20>鲁花11。3株发根农杆菌菌株在花育45平均发根诱导率为85.5%，花育20为82.4%，鲁花11为57.1%，花育45的平均发根诱导率是鲁花11的1.5倍；不同发根农杆菌菌株平均发根诱导率为：A4>GIM1.141>ATCC15834。GIM1.141菌株在3个花生品种的平均发根诱导率为76.7%，A4为77.1%，ATCC15834为71.2%，A4菌株的平均发根诱导率是ATCC15834的1.08倍；可见，花生品种影响发根诱导率的作用要高于发根农杆菌菌株的作用。同时花生品种和发根农杆菌存在显著交互作用。花育45的适宜发根农杆菌菌株为A4，发根诱导率为93.7%；花育20的适宜发根农杆菌菌株为ATCC15834，发根诱导率为89.2%；鲁花11的适宜发根农杆菌菌株为GIM1.141，发根诱导率为73.4%。

3 讨论与结论

本试验利用不同发根农杆菌转化不同花生品种子叶外植体，均获得了激素自主、多分支、多根毛、在无激素的MS0培养基上快速生长的发根，且诱导率相对较高。在鉴别方法上，可以从形态学角度判断发根[16]。试验所用的3株发根农杆菌菌株均属农杆碱型，T-DNA具有不连续性，有两个边界区域，即TL-DNA和TR-DNA。TL-DNA上存在与根的形态有关的基因[17]。TR-DNA上有生长素合成基因tms1和tms2，指导吲哚-3-乙酸（IAA）的合成，因此转化产生的发根在培养时不需要添加外源生长素，为激素自养型[18]。当T-DNA整合到植物基因组中，产生对生长素敏感度比普通根强100～1 000倍的负向地性的发根[19]。本试验获得的发根为激素自养型，且表现明显负向地性，说明T-DNA成功整合到植物基因组中。

研究表明，发根农杆菌遗传转化效率受到菌株种类、寄主植物种类和培养条件的影响，特别是植物基因型是公认的影响农杆菌转化效率的主要限制因素[20]，说明品种的选择是建立高效发根诱导体系和培养体系的关键因素，本试验结果也证实了这一点。发根农杆菌菌株影响花生发根诱导率，可能是由于发根农杆菌的致根特性与其所带Ri质粒的类型有关[21]。花育45、花育20和鲁花11的最适宜发根农杆菌菌株分别为A4、ATCC15834和GIM1.141。以上结果可为建立花生发根培养体系奠定基础。

参 考 文 献：

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