南极菌株SC—5同步糖化发酵甜高粱秆生产纤维素乙醇的研究

马德源 范仲学 郭凤丹 王能飞 王颖 张斌

摘要：利用从南极土壤中分离筛选的产低温纤维素酶菌株SC-5，以甜高粱秆为发酵底物，开展同步糖化发酵生产纤维素乙醇试验研究。结果表明：SC-5低温纤维素酶，底物亲合性好，最适pH值为6.0，最适作用温度为40℃，pH适应性广，热稳定性好，乙醇耐受性好。同步发酵1.0 kg甜高粱秆可生产45 g乙醇，乙醇生产效率较高，发酵工艺简单实用。

关键词：低温纤维素酶；甜高粱秆；同步发酵；纤维素乙醇

中图分类号：S514.099文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0139-04

Abstract The strain SC-5 producing low temperature cellulase was isolated from the Antarctic soil. With the sweet sorghum stalks as substrate， the experiment was carried out for simultaneous saccharification and fermentation to produce cellulosic ethanol using SC-5.The results showed that the SC-5 strain had stronger ability to produce low-temperature cellulase， better substrate affinity， wider pH adaptability， better thermostability and tolerance to ethyl alcohol.The optimum pH value was 6.0， and the optimum temperature was 40℃. With SC-5， simultaneous saccharification and fermentation of 1.0 kg of sweet sorghum stalks could produce 45 g of ethanol. All these indicated that the fermentation process was simpler and the production efficiency was higher.

Keywords Low-temperature cellulose；Sweet sorghum stalk； Simultaneous fermentation；Cellulosic ethanol

利用纖维素酶发酵木质纤维素生产燃料乙醇是解决当前能源紧张、资源短缺、环境恶化等现实问题的有效途径，具有良好的发展前景。当前，以木质纤维素为原料生产乙醇的工艺主要包括底物处理、水解和发酵三个环节，但由于发酵过程中产生的底物抑制效应，显著降低了纤维素酶发酵能力和水平。在前期研究中本课题组从南极土壤中筛选了一株产低温纤维素酶菌株SC-5，该菌株具有最适生长温度与酿酒酵母相接近的特性，产生的低温纤维素酶能够解决纤维素酶水解最佳温度和酵母最佳发酵、生长温度不一致及底物抑制等问题。基于此开展同步发酵生产乙醇的小试研究，最终建立起木质纤维素同步糖化发酵技术体系[1-4]。

甜高粱作为能源作物，茎秆含糖量高，在国内外被广泛用作生产燃料乙醇的原料[5-7]，利用甜高粱生产无水乙醇产量得率较高[8]。山东省农业科学院作物研究所培育的甜高粱新品种“济甜杂2号”具有生物学产量高、茎秆多汁、含糖锤度高等特点，是生产生物乙醇的良好底物，且其耐盐抗逆性强，是黄河三角洲盐碱地经济作物种植的良好选择。本研究拟以“济甜杂2号”为原料，利用SC-5菌株进行同步糖化发酵生产纤维素乙醇。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵菌株SC-5由本实验室保存。发酵底物“济甜杂2号”甜高粱秆取自山东省农业科学院作物研究所试验田。酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产的酿酒活性干酵母。常规化学试剂均为国药集团生产。

1.2 试验方法

1.2.1 不同pH值、温度对SC-5纤维素酶的影响 在配置不同pH缓冲液的基础上测定滤纸酶活，pH值分别设为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，筛选出最适pH值。在最适pH缓冲液中加入酶液，设置不同温度梯度（25、33、35、38、40、43、46、50、55℃）进行酶活测定，以最高酶活值为参照分别作图。

1.2.2 SC-5纤维素酶热稳定性、pH稳定性测定 分别将酶液保存在不同温度（23、30、35、42℃）下，间隔30 min测定酶活；分别将酶液调置成不同pH值（pH值设为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），1 h后回调为最适pH值测定酶活，以初始酶活为参照作图。

1.2.3 乙醇对SC-5纤维素酶活性的影响 在不同乙醇浓度下（5%、10%、15%、20%、25%），测定SC-5纤维素酶酶活，以零添加乙醇为参照作图。

1.2.4 发酵底物甜高粱秆预处理 将1.0 kg冷冻甜高粱秆解冻，切成长度2～4 cm小段，用粉碎机粉碎；按照1∶15（g：mL）的固液比，将粉碎的高粱秆与1.5%（W/W）的H2SO4混匀分别装入容器内，装料系数大约为80%，高温处理0.5 h（121℃），用10 mol/L NaOH将其pH调至5.2；将瓶中酸化处理后的高粱秆经过滤后，烘干渣滓备用。

1.2.5 活性干酵母活化 称取10 g干酵母放置于1 000 mL三角瓶中，加入无菌葡萄糖（2%）溶液1 000 mL，充分搅拌混匀，30℃活化1.5 h。

1.2.6 制备发酵酶液和发酵培养基 将SC-5发酵液进行离心，取上清即发酵酶液，并进行酶活力检测。按照成分配比[酵母粉6%，蛋白胨10%，尿素0.4%，（NH4）2HPO4 0.2%]制备20倍发酵培养基，121℃灭菌20 min。

1.2.7 底物发酵 采用同步糖化发酵：按照15 PFU/g甜高粱秆加入适量体积的SC-5发酵上清液。加入相应发酵上清液20倍体积的发酵培养基。按照15%的比例接种酵母，36℃、100 r/min振荡培养24 h。

1.2.8 测定发酵乙醇浓度 乙醇浓度标准曲线绘制：分别取0.9%、0.7%、0.5%、0.3%、0.1%的乙醇标准溶液2.0 mL分别放入样品瓶，95℃加热5～10 min，完全蒸发掉乙醇后，取样1.0 mL气相色谱测试，制作出标准曲线。将同步糖化发酵液离心15 min（5 000 r/min），上清液经滤膜抽滤。然后将待测液放入样品瓶，95℃加热5～10 min，完全蒸发掉乙醇后，取样1.0 mL气相色谱测试，对比标准曲线算得乙醇浓度。

2 结果与分析

2.1 SC-5纤维素酶反应条件及酶活分析

2.1.1 不同pH值、温度对SC-5纤维素酶的影响 如图1所示， SC-5纤维素酶活性在pH值为6.0时最高，同步糖化发酵底物纤维素处理采用稀硫酸法处理，因此发酵pH环境与SC-5纤维素酶同步发酵最佳pH值相一致。

如图2所示，SC-5纤维素酶在35～50℃条件下酶活较高，最适温度为40℃，该温度远远低于其他纤维素酶最适温度（50℃），属于低温纤维素酶的范围。

2.1.2 SC-5纤维素酶热稳定性、pH稳定性测定 如图3所示，35℃处理1 h，酶活力保持85%左右，SC-5纤维素酶属于热稳定较好菌株，对后续同步糖化发酵具有良好的温度选择性。

如图4所示，在pH值6.0环境下保持1 h，酶活能够保持85%，pH值为4.0～8.0时，酶活力保持在60%左右，表明SC-5纤维素酶具有较广的pH适应范围。

2.1.3 乙醇对SC-5纤维素酶活性影响 如图5所示，SC-5纤维素酶能够耐受较高的乙醇浓度，在乙醇浓度升至20%时，酶活还能够达到40%，乙醇浓度在15%时，酶活能够保持在60%，表明SC-5纤维素酶对发酵底物乙醇的耐受性较高，有利于同步糖化发酵反应。

2.2 同步糖化发酵

在发酵温度36℃、pH值6.0条件下，对甜高粱秆进行同步糖化发酵生产纤维素乙醇，根据绘制的标准曲线（图6）得到发酵液所含乙醇浓度，經乙醇密度表计算得出1.0 kg甜高粱秆经SC-5产低温纤维素酶发酵可生产45 g乙醇。

3 讨论与结论

3.1 发酵温度对同步糖化发酵周期长短和乙醇得率影响较大，是影响发酵水平的关键因素。目前，同步糖化发酵纤维素反应通常采用的纤维素酶最适温度在50℃以上，而酵母最适温度在30℃左右，两者在温度适应方面存在着显著差异，严重影响同步糖化发酵反应效率。通过上述研究表明，SC-5纤维素酶最适温度为40℃，该温度远远低于其他纤维素酶最适温度，与酿酒酵母的最适生长温度较为接近。将发酵温度设置为36℃，最大程度兼顾了SC-5纤维素酶活和酿酒酵母生长。SC-5纤维素酶最适pH值为6.0，与酿酒酵母最适生长pH值（pH值4.5～5.0）较为接近，也有利于同步糖化发酵反应。

3.2 通过开展SC-5纤维素酶热稳定性、pH稳定性及乙醇耐受性试验，表明在pH值6.0时，SC-5纤维素酶活性能够保持在85%左右，pH值为4.0～8.0时，酶活保持在60%左右，表明SC-5纤维素酶pH适应性较广；35℃处理1 h，酶活力保持85%左右，表明SC-5纤维素酶热稳定较好。乙醇浓度在15%时，酶活能够保持60%左右，表明乙醇SC-5纤维素酶对乙醇的耐受性较高。

3.3 在底物处理过程，利用稀硫酸处理甜高粱秆是为了破坏木质素的晶体结构，促进酸催化水解过程的发生。由于木质素能够络合纤维素酶，将增加纤维素酶的用量，导致成本增加，因此木质素预处理程度是提升纤维素酶酶解效率的重要因素。底物酸化是发酵的重要环节，调定酸化处理甜高粱秆处理液pH值时，对高温处理后的固液物充分搅拌混匀，保持发酵环境稳定的pH值是提高发酵产率的必要条件。

3.4 同步发酵过程中，为提高SC-5发酵液的酶活力，加入适量20倍的发酵培养基，再以15%比例加入活化的酵母，保持温度在36℃，保证了发酵液酶活力，实现了酵母最适发酵温度下的同步发酵。经充分振荡培养，增加了发酵液溶氧比例，形成了酵母耗氧繁殖和无氧发酵环境，提高了乙醇发酵产率。

3.5 试验结果显示，在发酵温度36℃、pH值6.0条件下，1.0 kg甜高粱秆共生产出约45 g乙醇，说明菌株SC-5产生的低温纤维素酶具有较强的活性，能够与酿酒酵母在相同的温度、环境条件下实现同步发酵，且产物得率较好。本研究建立的木质纤维素同步糖化发酵技术体系，简化了生产过程和环节，节约了生产成本，提高了乙醇生产效率。

3.6 在后续工作中将进一步优化甜高粱秆的前处理方式，减小原料颗粒直径，提高水解效率。通过诱变等方式进一步改良菌株特性，提高纤维素酶活力，建立更加优化的同步发酵生产技术体系；在生产纤维素乙醇的同时，能够生产高附加值的木糖及肥力高的有机肥等副产品，增加附加经济效益，提升该产业链价值，不断加快该技术在生产中的推广应用。

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