山东省及周边地区肉鸭源大肠杆菌流行病学调查及耐药性分析

2018-03-29骆延波李兰波贾纪美齐静李璐璐胡明刘玉庆邓旭明

山东农业科学 2018年2期

骆延波李兰波贾纪美齐静李璐璐胡明刘玉庆邓旭明

摘要：为建立鸭大肠杆菌快速鉴定及药敏检测方法，筛选合适的抗生素，本试验从山东省12个、河北4个及河南4个地区养殖场或养殖小区采集到447份疑似感染鸭大肠杆菌的肉鸭肝脏和脑部组织病料，共分离到300株大肠杆菌，分离率为67.11%。利用大肠杆菌phoA基因为目的基因，建立了PCR快速鉴定鸭源大肠杆菌的方法。该PCR检测方法可快速鉴定鸭源大肠杆菌，鉴定效率显著提高。根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准及琼脂稀释法药敏试验原理，建立了96点接种药敏检测盒快速检测方法，结果表明：硫酸多粘菌素、甲磺酸培氟沙星抑菌率相对较高；卡那霉素、氨苄西林、氟苯尼考抑菌率相对较低。根据药敏检测结果可快速筛选适用的敏感药物和剂量，并交替轮流使用抗生素。

关键词：鸭；大肠杆菌；药敏试验；多重耐药

中图分类号：S858.322.61+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0119-05

Abstract This study was aimed to establish the methods for rapid separation and identification of Escherichia coli from ducks and drug susceptibility test， and screen proper antibiotics. We collected 447 histological materials including livers and brains from ducks with suspected coli bacillosis from 12 districts or cities of Shandong Province， 4 cities of Hebei Provice and 4 cities of Henan Province.Based on the phoA gene，a PCR method was established for rapidly identifying Escherichia coli from ducks. By this method， 300 strains of Escherichia coli were identified with the isolation rate as 67.11%. This PCR method could be used to rapidly identify Escherichia coli from ducks， and the identification efficiency was significantly improved. According to the standard of the Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI） and agar dilution method， the rapid detection method of 96 array antimicrobial susceptibility test was established. The results showed that the antibacterial rate of polymyxin sulfate and pefloxacin mesylate were higher，while that of kanamycin， ampicillin and florfenicol were relatively lower. So the optimal sensitive drugs and doses could be screened out according to the drug sensitivity test results， and the antibiotics could be used alternately.

Keywords Duck； Escherichia coli； Antibiotic susceptibility test； Multi drug resistance

鸭大肠杆菌感染是目前肉鸭养殖业中最为常见的细菌性传染病之一，而且该菌常与其它细菌混合感染[1-3]。抗生素作为细菌感染的有效治疗手段得以普遍应用，但是近些年来广谱抗菌药的滥用以及细菌间耐药基因的转导等因素，导致鸭大肠杆菌表现出了普遍的多重耐药性[4-8]，不同地区分离到的鸭大肠杆菌对不同抗菌药的敏感程度存在较大差异[9-11]，进行大批量鸭大肠杆菌鉴定及药敏试验需要耗费相当长的时间才能得到相应的结果，给该病的诊断与治疗造成了极大的困难。针对目前山东省及周边地区肉鸭养殖中细菌传染病发病率高、防治困难，同时传统的鸭大肠杆菌鉴定及药敏试验方法检测效率较低的现状，本研究建立了鸭大肠杆菌的PCR快速鉴定方法，并根据CLSI琼脂稀释法药敏试验原理，建立了96點接种药敏检测盒，菌株的分离检测效率大大提高，并可为兽医临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从山东省12个地区、河北4地区及河南4地区养殖场或养殖小区采集到447份疑似鸭浆膜炎的病鸭肝脏及脑部组织病料。

1.1.1 培养基与试剂麦康凯培养基，MH培养基，伊红美蓝培养基，大肠杆菌显色培养基，TSA培养基，TSB培养基；新生牛血清，PCR反应试剂（Taq酶、dNTP Mix、MgCl2、10×Loading buffer），DNA Marker（DL2000 plus），PMD18-T载体，DH5α感受态细胞，核酸胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，琼脂糖，50×TAE电泳缓冲液，氨苄青霉素（Amp）贮存液，LB+Amp平板，1%琼脂糖凝胶等。

1.1.2 试验药物购自青岛康地恩药业有限公司，主要成分分别为氨苄西林钠、乳酸环丙沙星、硫酸多粘菌素、硫酸卡那霉素、甲磺酸培氟沙星、氟苯尼考、磺胺氯哒嗪钠、痢菌净、多西环素等。

1.1.3 主要试验仪器 96孔聚乙烯板药敏检测盒；VD-650型桌上式超净台；LDZX-40SBI高压灭菌锅；DYY-2电泳仪；移液器（德国Eppendoff公司）；凝胶成像系统；HPP-9162电热恒温培养箱；生物安全柜；Ultrospec 3100 Pro紫外分光光度计（英国Biochrom公司）； FA2104N电子分析天平；HZQ-C空气浴振荡器；PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 大肠杆菌分离培养从病死鸭病变组织（肝、脑等）中无菌穿刺采样，接种于装有2 mL灭菌LB琼脂培养基的穿刺管中培养36～48 h；之后用接种环从穿刺管中心插入，抽出后划线接种于伊红美蓝培养基平皿，37℃倒置培养16～18 h，即可出现紫黑色、带金属光泽的圆形疑似大肠杆菌菌落。取疑似菌落划线接种于大肠杆菌显色培养基平板，37℃倒置培养16～18 h进行纯化。钩取纯化菌落涂片，革兰氏染色后镜检，进行后续生化及分子鉴定。

1.2.2 生化鉴定取疑似菌落分别接种于五糖发酵管、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基、醋酸铅琼脂上进行糖发酵（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇）试验、吲哚试验、MR试验、VP试验、枸橼酸盐试验、硫化氢试验，置于37℃培养2～3 d观察结果。

1.2.3 分子鉴定将分离菌株无菌划线接种于TSA培养基上，挑取单菌落于MH液体培养基中，37℃摇床培养18～24 h，离心，弃上清，用50 μL灭菌水悬浮沉淀，放入沸水浴中煮沸10 min，取出后迅速放入冰块中，冷却5 min，12 000 r/min离心3 min，吸上清液作为DNA模板，并保存于-20℃备用。

参考文献[12]～[14]，选取大肠杆菌phoA保守基因为目的片段设计引物，引物序列为F：5′-CGATTCTGGAAATGGCAAAAG-3′，R：5′-CGTGATCAGCGGTGACTATGAC-3′，扩增序列长度750 bp。检测基因的PCR反应体系见表1，反应程序为：94℃预变性10 min；94℃变性50 s，54℃退火45 s，72℃延伸50 s，共32个循环；最后72℃再延伸10 min[15，16]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行进目的核苷酸克隆测序，并用DNAStar MegAlign进行多序列比对，确定种属关系。

1.2.4 琼脂稀释法药敏试验首先按照CLSI标准或临床推荐剂量稀释药物至L值（兽药成品的L值等于养殖户治疗动物疾病使用的药物浓度或者CLSI标准“R”值），然后设置L/4、L/2、L、2 L、4 L五个浓度梯度。

菌液制备：将分离得到的大肠杆菌菌液200 μL按顺序接入96孔板Ⅰ中，每板接48株菌为宜，之后取96点阵板扣入已接菌液的96孔板Ⅰ中，充分接触后，把96点阵板扣入每孔装有200 μL LB液体的96孔板Ⅱ中，充分接触后，再把此点阵板扣入每孔装有200 μL LB液体的96孔板Ⅲ中，充分接触后，保留96孔板Ⅲ（每孔菌液浓度约为105 CFU/mL），同时做好标记，记录菌株顺序。

菌液接种：首先在9 cm平皿上依次标明待测药物名称与药物浓度梯度，并各加入20 mL高压灭菌水，然后在每种药物的4 L浓度平皿中加入20 mL待测药物，其余各皿按药物浓度依次进行梯度稀释。分别向每个96点阵药敏检测盒中加入18 mL高压灭菌且冷却至55℃左右的MH琼脂与2 mL不同浓度梯度的待测药物，并立即混匀，同时避免产生气泡（此时每种药物的浓度依次为8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL）。然后使用多位点接种器接种96孔板Ⅲ中菌液至96点阵药敏检测盒琼脂表面，首先接种无抗菌药物的对照盒，然后从每种药物的最低药物浓度至最高药物浓度依次开始接种。将接种后的96点阵药敏检测盒在室温静置至接种点的水分被琼脂完全吸收，干燥，但整个过程不能超过30 min。然后将平皿倒置于培养箱中培养16～20 h。

结果判定：有菌生长，此药物浓度无效；无菌生长，此药物浓度有效。

2 结果与分析

2.1 细菌分离结果

从山东、河北、河南部分区、市采集到的447份病鸭的脑、肝组织病料中共分离到大肠杆菌300株，分离率为67.11%。

2.2 培养特性、镜检及生化鉴定结果

在伊红美兰琼脂平板上长出紫黑色、带金属光泽的圆形菌落，疑似为大肠杆菌菌落；另有少数样品在伊红美兰琼脂平板上出现乳白、边缘不规则菌落，判为杂菌。疑似大肠杆菌在显色培养基上纯化，挑取纯化的单菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察记录菌体形态和染色特征。大肠杆菌染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。最终鉴定结果为300株大肠杆菌。生化反应见表2。

2.3 分子鉴定结果

对大肠杆菌phoA基因进行PCR 扩增，结果300株大腸杆菌均扩增出750 bp特异性条带（图1）。阳性扩增产物经纯化测序后，通过NCBI BLAST比对分析发现，均与其标准菌株有高达99%的同源性。根据同源性达到99%以上为同一种属的原则，可以判定其为同一种属， phoA是保守的特异性基因，可以作为大肠杆菌快速检测的候选基因之一。

2.4 药敏试验结果

如表3所示，硫酸多粘菌素、甲磺酸培氟沙星、痢菌净、多西环素、环丙沙星抑菌率相对较高，可作为目前选用的主要药物。硫酸卡那霉素、氨苄西林、氟苯尼考长期用于兽医临床，抑菌率较低，建议暂时不用该类抗生素。

多重抗药性现象严重（表4）。以L值作为抗药性判定标准，300株大肠杆菌中不存在单重抗药株，二重抗药占比3%，三重抗药17%，4重抗药10%，5重以上抗药共占70%。这与长期使用复方抗生素有很大关系。

3 讨论与结论

3.1 大肠杆菌分离培养

本研究中从447份病死鸭的肝、脑组织病料共分离到大肠杆菌300株，分离率较高。大肠杆菌分离率明显高于沙门氏菌和里默氏杆菌，表明从总体来看，在疑似鸭浆膜炎病传播中大肠杆菌仍是主要致病菌。虽然从细菌分离率来看，沙门氏菌和里默氏杆菌要低的多，但是由于其致病力更强、致死率更高，这两种病原菌也不容忽视。

3.2 大肠杆菌鉴定

大肠杆菌可以通过菌落形态观察、选择性培养鉴定、生化反应[17-20]等传统技术手段相互配合来进行鉴定，但这些方法操作繁琐，灵敏度低、特异性差。phoA是大肠杆菌内特异性较高的基因，编码磷酸酯分解酶A。本研究在该基因上选取目的片段，设计PCR引物，对受试菌株进行PCR检测，检测结果与生化鉴定相符，而且其特异性更高、灵敏性更强，可以作为快速检测方法。

3.3 大通量琼脂稀释法药敏试验

药敏试验方法多样，耗费低、耗时少，试验结果在临床用药中具有很高的指导意义，是一种标准化的、易于掌握和操作的技术，但即便如此在畜牧生产中远没有被有效的利用。本试验改进CLSI药敏试验体系，以临床推荐剂量为准，设定多个梯度，基于琼脂稀释法建立了大通量筛选敏感药物及其适宜的临床使用剂量的方法。试验结果表明该方法易于确认结果，比标准的纸片扩散法更准确且效率高，比微量肉汤稀释法药敏试验的效率提高10倍，适合高通量药敏检测。结合穿刺采样，集中多种鉴定检测策略，我们相对高效地完成了覆盖山东全省的抗药性普查，并针对各地区现状推荐了适宜的抗菌药物及剂量。利用该方法可以建立养殖厂区内及更大区域内动态的药敏检测系统，以便筛选有效药物，用于药物区域轮换。

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