青藤碱对佐剂诱导性关节炎模型大鼠炎症相关因子表达的影响*

赵 静，刘伟伟，李雪萍，高永翔

(成都中医药大学基础医学院病理生理学教研室，成都 610075)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的以关节慢性炎症为主要表现，伴有关节外的各系统损伤的自身免疫性疾病[1]。RA的病因及发病机制仍不甚明确，为多种因素共同作用的结果，包括：遗传因素、感染、基因突变、滑膜细胞的演变、炎性细胞浸润及促炎细胞因子和趋化因子的释放等。但自身免疫及细胞因子网络的紊乱在RA发生和发展中发挥的关键作用已经得到广泛的认可[2]。清风藤用于治疗风湿性疾病历史悠久，李时珍在《本草纲目》中称清风藤“主治风疾，治风湿流注、历节鹤膝”。青藤碱是清风藤的单体提取物。现代药理研究显示,青藤碱具有显著的镇痛镇静、抗炎、免疫抑制等药理作用,但青藤碱的免疫抑制和抗风湿的机制尚未完全阐明[3]。为进一步探讨青藤碱抗RA的作用及机制，本实验通过复制佐剂诱导性关节炎(AIA)大鼠模型，选取炎症相关细胞因子进行研究，探讨青藤碱对类风湿关节炎相关细胞因子的影响及其免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 清洁级SD大鼠96只，7周龄，雌雄各48只，体质量(200±10)g，购自成都达硕生物科技有限公司，质量合格证号No.0006045，许可证号SCXK(川)2008-11。

1.1.2药物 甲氨蝶呤，购自上海信谊药制药有限公司，批号H31020644。以临床常用量换算为大鼠等效剂量作为本实验剂量，每3天1次(0.51 mg·kg-1·d-1)。盐酸青藤碱，购自宝鸡市永嘉天然植物开发有限公司，批号YJ0110822A。参照陈奇编著《中药药理研究方法学》，在多次给药实验后，给药浓度确定为按临床用量240 mg进行折算后6.25倍作为中剂量组，本实验中盐酸青藤碱低、中、高剂量组分别设计给药量为30、60、120 mg·kg-1·d-1。

1.1.3试剂 完全弗式佐剂，Sigma公司，每瓶10 mL。卡介苗(BCG)，成都生物制品研究所，每瓶5 mg；白细胞介素(IL)-1检测试剂盒(R&D公司，货号：CK-E30418R)；IL-6检测试剂盒(R&D公司，货号：CK-E30646R)；IL-10检测试剂盒(R&D公司，货号：CK-E30651R)。

1.1.4仪器 酶标仪：Thermo Mulliskan Ascant公司；显微镜：德国莱卡显微镜，德国莱卡病理图像分析系统DM2000。

1.2方法

1.2.1造模 SD大鼠常规条件下饲养，自由饮水，普通饮食，适应性喂养7 d后，取80只大鼠，雌雄各40只，参照文献[4]采用完全弗氏佐剂(CFA)诱导法复制类风湿关节炎大鼠模型，即取CFA每支10 mL，在冰浴下与卡介苗混合，配制成含卡介苗10 mg/mL的水包油乳剂，对大鼠予以每只0.1 mL左足趾皮下注射。取16只大鼠，雌雄各8只，予生理盐水以每只0.1 mL左足趾皮下注射。第14天加强免疫，操作方法同前，注射部位改为尾部皮下，制成AIA模型。

1.2.2分组和给药 加强免疫7 d后取注射CFA的80只大鼠，雌雄各40只，分成模型组、甲氨蝶呤组、青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组、青藤碱高剂量组；取注射生理盐水的16只大鼠为正常对照组。甲氨蝶呤组灌胃给药剂量为0.51 mg·kg-1·d-1，青藤碱低、中、高剂量组灌胃给药剂量分别为30、60、120 mg·kg-1·d-1，正常对照组和模型组给予10 mg·kg-1·d-1生理盐水灌胃，连续给药21 d。

1.2.3取材 末次给药后禁食禁水12 h，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射，辅以乙醚吸入麻醉大鼠。每组选取大鼠6只，剖开大鼠腹腔，腹主动脉取血并处死大鼠，离断大鼠注射侧足髋关节，取包含踝关节的足部。血液经3 000 r/min离心10 min后取上清液备用，离断的大鼠含踝关节的足置于4%多聚甲醛中固定备用。

1.2.4指标检测

1.2.4.1病理观察及半定量评分 标本经乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，行苏木素-伊红(HE)染色。光镜下观察关节的病理改变，根据滑膜炎病理改变：滑膜衬层细胞层数、血管翳形成、炎性细胞浸润、新生血管/毛细血管；骨/软骨破坏：骨侵蚀、软骨侵蚀、关节粘连、关节结构破坏；关节修复：新生骨、新生软骨10项基本病变的不同严重程度(正常、轻度、中度、中度)给予0～3分，进行病理学半定量分析。

1.2.4.2全自动血生化仪检测大鼠血清类风湿因子(RF)和C反应蛋白(CRP)水平 以标记后的血生化采血管(红色)，从大鼠腹主动脉采取抗凝血3 mL。以全自动血生化仪检测各组大鼠RF和CRP的水平。

1.2.4.3ELISA法检测大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10的水平 根据ELISA试剂盒使用说明书中标准操作方法进行，每组选6只大鼠血清，ELISA法检测给药21 d后的大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10水平，在酶标仪(λ=490 nm)测定吸光度(A)值。

2 结 果

2.1青藤碱对大鼠关节病理损伤的影响 正常对照组大鼠关节腔均未见病变(图1A)。模型组大鼠关节腔几乎完全消失，出现弥漫性滑膜细胞和纤维组织增生，血管翳形成，填满关节腔；多灶性区域出现炎性细胞聚集和新生毛细血管形成，并向软骨和骨组织浸润，软骨和骨破坏现象多见；灶性区域可见新生骨/软骨组织形成(图1B)。甲氨蝶呤组(图1C)、青藤碱低剂量组(图1D)和青藤碱中剂量组(图1E)，虽然呈现明显的关节腔狭窄、腔内有炎性渗出物，以及关节囊测的滑膜组织明显增生和血管翳形成，但其程度低于模型组；灶性区域仍可见炎性细胞浸润和新生毛细血管形成，软骨和骨破坏现象也在部分切片中出现，但出现的频率和程度均远低于模型组，此3组的病理学积分与模型组比较显著降低。青藤碱高剂量组病理改变及病理学积分虽比模型组有所改善和降低(图1F)，但差异无统计学意义(P>0.05)。各实验组大鼠关节组织病理学积分统计结果见图2。

A：正常对照组；B:模型组；C:甲氨蝶呤组；D:青藤碱低剂量组；E:青藤碱中剂量组；F:青藤碱高剂量组

图1大鼠关节组织病理切片(HE，×400)

表1 青藤碱对各组大鼠IL-1、IL-6、IL-10的水平的影响

a：P<0.05，b：P<0.01，与模型组比较

n=6；a：P<0.05，与模型组比较;b:P<0.05,与青藤碱高剂量组比较

图2各实验组大鼠关节组织病理学积分

2.2青藤碱对大鼠血清RF和CRP表达水平的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清RF和CRP水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，甲氨蝶呤组、青藤碱低、中、高剂量组RF水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图3；甲氨蝶呤组，青藤碱低、中、高剂量组，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，见图4。

n=6；a：P<0.05，与模型组比较

图3各组大鼠血清RF水平比较

n=6；a：P<0.05，b：P<0.01，与模型组比较

图4各组大鼠血清CRP水平比较

2.3青藤碱对大鼠血清炎症相关细胞因子表达水平的影响 模型组大鼠与正常对照组相比，IL-1、IL-6水平明显上升，IL-10水平则明显下降，且差异均有统计学意义(P<0.01)。用药后，甲氨蝶呤组和青藤碱低、中剂量组与模型组相比，IL-1、IL-6水平下降，IL-10水平上升，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。青藤碱高剂量组与模型组相比，指标下降但差异无统计学意义(P<0.05)。见表1。

3 讨 论

根据RA的临床表现特征，其归属于中国传统医学的“历节”“痹病”范畴。如《金匮要略·中风历节病脉证并治》提出：“病历节不可屈伸疼痛”“诸肢节疼痛，身体魁赢，脚肿如脱”，其中对症状的描述，与RA有相似之处[5]。中医学理论认为，风寒湿邪为“痹病”发生的重要外在因素，痰淤互结是痹症产生的关键病机，其治疗常用清热解毒、祛风散寒，活血化瘀、补益肝肾等法。清风藤为防己科植物青藤、华防己或清风藤科植物清风藤等的藤茎，李时珍在《本草纲目》中称清风藤“主治风疾，治风湿流注、历节鹤膝”[6]。《本草汇言》记载：“清风藤，散风寒湿痹之药也，能舒筋活血，正骨利髓，故风病软弱无力，并劲强偏废之证，久服常服，大建奇功”[7]。青藤碱是清风藤的单体提取物，现代药理研究证实,青藤碱具有显著的镇痛、镇静、抗炎、免疫抑制等药理作用，临床用于治疗风湿病常有良效[3]。

现代医学研究证实，机体免疫功能紊乱，免疫细胞及细胞因子网络失衡是RA重要的发病机制和表现形式，尤其是细胞因子IL-1、IL-6和IL-10在其中发挥重要作用。IL-1是目前已知的RA中最重要的炎性细胞因子之一。血浆和滑膜中的IL-1水平，与关节炎性活动水平、关节破坏进展直接相关。RA的IL-1主要来源于活化的巨噬细胞，可由肿瘤坏死因子(TNF)-α或IL-1自身刺激产生，具有促进自我分泌的能力，能将炎症信号迅速放大。滑液中的IL-1会刺激前列腺素E2、一氧化氮(NO)和基质金属蛋白的表达，促进关节的破坏；并能抑制胶原的合成而抑制关节修复，刺激破骨细胞重吸收骨。此外IL-1作为内生致热源，能激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，并使巨噬细胞活化释放各种蛋白水解酶和趋化因子[8-10]。IL-6也是RA中重要的促炎细胞因子。当滑膜成纤维细胞受到促炎细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-17等刺激时，能大量产生IL-6，继而通过诱导新生血管形成、促进炎性细胞浸润和促进滑膜细胞增生，促进滑膜炎性进程。此外，IL-6还能诱导滑膜细胞和软骨细胞产生金属蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)，刺激破骨细胞形成，引起骨质吸收[11]。更重要的是IL-6还能通过破坏Th17和Treg之间的平衡参与自身免疫性疾病的发病[12]。由于其在发病中的核心地位，IL-6已成为一个独立的阻断靶点。同进针对IL-6的单抗已进入Ⅲ期临床试验，并被证实有效。而与IL-1和IL-6相反，IL-10是RA疾病过程中，比较重要的抑炎因子。作为Th2细胞的代表细胞因子，IL-10具有很强的免疫抑制及免疫调控作用，在RA的发病环节中能抑制IL-8，粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等炎症因子的释放，拮抗相关TH1细胞因子，从而发挥对RA的抑制作用[13-14]。

如上所述，IL-1和IL-6是RA疾病进程中重要的促炎因子，与关节炎性反应和关节破坏程度呈正相关；IL-10则是重要的抑炎因子，与关节炎性反应呈负相关。同时血液中的IL-1、IL-6 和IL-10水平还能反映RA发生时机体的全身免疫状态。本实验选取上述3个因子作为RA发生时炎性细胞因子网络失衡的代表，以期探讨青藤碱能否通过调节机体免疫状态，恢复促炎因子与抑炎因子的失衡状态，进而发挥治疗作用。

RF和CRP 与RA的临床表现和关节损伤程度密切相关，在一定程度上反映 RA的疾病活动度[15]。本实验研究结果显示，造模处理后，模型组大鼠RF和CRP水平明显升高，同时血清IL-1和IL-6水平升高，IL-10水平降低，大鼠关节病理损伤程度半定量评分明显增加，提示佐剂诱导性AIA模型复制成功；经过灌胃给药治疗后，甲氨蝶呤组及青藤碱低、中、高剂量组大鼠血清CRP水平明显低于模型组，青藤碱低、中剂量组大鼠血清IL-1和IL-6水平降低，IL-10水平上升，大鼠关节病理损伤程度半定量评分也相应降低，提示青藤碱对佐剂诱导性AIA模型大鼠具有治疗作用。青藤碱高剂量组大鼠关节组织病理评分、血清IL-1、IL-6和IL-10水平变化与模型组比较均无显著差异，可能为高剂量青藤碱免疫抑制的药理作用减弱，反而对大鼠脏器产生不良反应，有待进一步研究证实。已有研究报道显示，大剂量青藤碱可导致大鼠肝脏损伤，且脏器损伤程度与药物在组织中浓度呈正相关[16]。青藤碱能明显减轻关节腔内的炎性反应，抑制滑膜组织增生及血管翳的形成，减轻软骨和骨组织浸润及关节腔的破坏，可能与青藤碱抑制模型动物的血清IL-1和IL-6的上升趋势，同时促进IL-10的分泌有关。这一现象既能够反映青藤碱对模型组的治疗作用，同时也揭示了部分可能的治疗作用机制，即青藤碱可能通过下调血清促炎细胞因子IL-1和IL-6的表达，上调抑炎因子IL-10的表达，对RA的细胞因子网络进行调节，阻断或干扰其后续炎性反应，减轻滑膜血管翳增生和软骨破坏。青藤碱对促炎因子与抑炎因子失衡状态的调节作用，与中医治疗疾病 “调节阴阳，以平为期”最终目的不谋而合。

尽管发现了青藤碱能对部分细胞因子起调控作用，从而发挥其抗炎效应。但针对点状模式的细胞因子网络，并不能全面解释其对RA炎性反应过程中，复杂的免疫调节过程。在实验后续机制探索部分，将应用基因芯片技术，全面检测全基因表达谱的改变，试图寻找位于网络结构中心的信号通路和基因，并分析之间相互联系。通过以上探索，可为后续发掘中药青藤碱对RA的治疗机制，拓展青藤碱在治疗自身免疫性疾病的应用打下基础。

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