毛细管气相色谱法测定山茱萸多糖的单糖组成

郑文静，孙 静，张 英

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸（Cornus of fi cinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，是我国传统中药材。山茱萸果肉中富含蛋白质、有机酸及其酯类、糖苷类及其苷元类、鞣质类、矿物质元素和多糖等成分，其中山茱萸多糖（Cornus officinalis polysaccharide）是主要的活性物质之一。近代药理学研究表明，山茱萸多糖不仅具有降血糖、降血脂的功效，还具有较好的免疫调节及抗氧化、抗衰老、保护心脑血管系统等生理活性[1]，可以作为保健食品、药品，应用前景广阔，有较高的开发价值，近年来已引起了人们的广泛关注。

本研究分别通过分光光度法与气相色谱法测定山茱萸多糖的糖含量与单糖组成，为进一步研究其活性和机制提供了一定的理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂及原材料

所用的标准单糖：鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖上海国药集团产品；正丙胺、硼氢化钠、咔唑苯酚、氢氧化钠、浓硫酸、正丁醇、95%乙醇、二氯甲烷等为分析纯试剂；山茱萸药材购于西安中药材市场，经鉴定为山茱萸科植物山茱萸（Cornus of fi cinalis Sieb. et Zucc.）的果实。

1.1.2 主要仪器

可见-紫外分光光度计Perkin Elmer Lambda 25；Shimadzu GC2010型气相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理方法

称取烘干粉碎的山茱萸用4倍体积的蒸馏水于30 ℃水浴中提取两次。在提取过程中让山茱萸浸出液保持在中性。水提液离心，取上清液减压浓缩后，用4倍体积95%乙醇醇沉24 h，离心，沉淀用少量蒸馏水溶解，加1/5体积Sevag试剂[氯仿：正丁醇=4：1（v/v）]除去游离蛋白质。透析2天，冷冻干燥，得到水提山茱萸多糖。

1.2.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量

分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7,0.8、0.9、1.0 mL标准单糖溶液于试管中，各管以蒸馏水补至2.0 mL，摇匀后分别加入50 μL 80%的苯酚与2.5 mL的浓硫酸，静置10 min后剧烈震荡至混匀，室温静置20 min，用直径10 mm的石英比色皿于490 nm测吸光度。以2 mL水按同样显色操作为空白，做3组样品取平均值[2]。横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，用Original 7.0绘制葡萄糖的标准曲线（见图1）。

图1 以葡萄糖为标准溶液的总糖测定曲线

准确称取山茱萸粗多糖样品50 mg于100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。准确吸取样品液0.25 mL，相当于山茱萸粗多糖样品0.125 mg。用同样的方法测定吸光度值，测定粗多糖中多糖的含量。

1.2.3 衍生化法测定单糖

标准单糖衍生化[3]：称取等摩尔的标准单糖，混合后加入1 mL水溶解，加入100 μL 0.5 mol/L Na2CO3调pH至9左右，于30 ℃水浴保温60 min。加入0.5 mL NaBH4溶液（含40 mg NaBH4）室温还原。加入冰醋酸中后洗脱液旋转蒸发至干，加甲醇蒸干以除去硼酸盐。然后加入1 mL吡啶和1 mL正丙胺，55 ℃加热30 min。旋转蒸发抽干溶剂，再加入吡啶和乙酸酐各2 mL，振荡混匀，室温过夜，然后减压抽干溶液，样品用氯仿溶解后，蒸馏水萃取3次，取氯仿层稀释后进行气相色谱分析。

样品的衍生化：取2 mg山茱萸多糖样品，加入2 mL 2 mol/L TFA，密闭，充氮气，121 ℃水解2 h，减压抽干。按照上述衍生化方法通过气相色谱同时检测中性糖和糖醛酸。

2 结果与分析

2.1 山茱萸多糖的含量

山茱萸经过浸泡、醇沉、除蛋白质、透析、冷冻干燥后，得到山茱萸粗多糖成分，得到的粗多糖呈紫红色疏松片状，得率为山茱萸生药的1%。粗多糖采用硫酸苯酚法测定其多糖含量为70.1%。

2.2 山茱萸多糖中单糖的测定

2.2.1 气相色谱条件

色谱柱：毛细管柱rtx-50柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），氢火焰离子化检测器 ，载气 N2，流 速 3 0 mL/min，进样量0.1 μL，进样温度230 ℃，FID 检测器温度230 ℃ ，程序升温条件为：180 ℃ (2 min)，6 ℃/min；210 ℃，0.3 ℃/min；215 ℃，6 ℃/min；240 ℃ (30 min)。

2.2.2 定性定量分析

按上述色谱条件分别对标准混合单糖溶液、山茱萸多糖样品溶液进行气相色谱分析，将样品图谱与标准图谱进行对照，根据保留时间推断样品中的单糖类型，根据标准图谱计算出各单糖的响应因子，由此计算得到山茱萸多糖中单糖组成的摩尔比。标准单糖与山茱萸多糖的气相色谱图如图2、图3所示。

图2 标准单糖衍生化产物的GC分析

根据标准图谱计算得到各单糖的响应因子，由此得到组成单糖的摩尔比。研究结果表明，山茱萸水提取粗多糖含有鼠李糖，阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖和葡萄糖醛酸，其摩尔比为2.2∶30.4∶1：5.4∶2.6，是富含阿拉伯糖的酸性糖。

图3 山茱萸多糖单糖气相色谱

3 结语

单糖本身挥发性不强，若采用常用的气相色谱法对其进行单糖组成分析，必须先将其转化为易挥发而且对热稳定的衍生物。一般在衍生化时多采用糖醇乙酸酯的衍生化方法，但该法只能检测中性糖。在本文中我们采用将中性糖和酸性糖同时衍生化的方法，利用气相色谱可以同时检测到中性糖和酸性糖。研究结果表明，山茱萸多糖是富含阿拉伯糖的酸性糖。

[参考文献]

[1] 李 晶，欧 芹，江旭东.山茱萸多糖对抗衰老模型小鼠肝组织SIRT1和p53基因表达的影响[J].中国老年学杂志，2015，35（4）：1885-1886.

[2] DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956（28）：350-356.

[3] LEHRFELD J.Simultaneous gas-liquid chromatographic determination of aldonic acids and aldoses[J].Analytical Chemistry，1985（57）：346.