烟碱样品前处理及分析方法研究进展

张佳杰， 孟子晖， 薛 敏， 魏天晔

(北京理工大学化学与化工学院，北京100081)

烟碱，又名尼古丁，分子式为C10H14N2，化学名为1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷，呈无色或淡黄色液体，广泛存在于烟草中，是烟草中含量最高的生物碱［1］。此外，在新鲜蘑菇、非烟草属茄科植物(如马铃薯、番茄、茄子等)中也检测到烟碱。一方面，烟碱含量过低严重影响烟叶及烟草制品的品质，国家相继出台卷烟五项“国家标准函”，其中烟碱含量始终作为评价卷烟质量的标准之一;另一方面，烟碱具有成瘾性，通过咀嚼、吸食烟草或烟草制品，烟碱随之进入人体，可存在于血液、尿液中，测定血浆、尿液等生物样品中烟碱的含量对监测吸烟者健康状况，研究烟碱在体内的作用机制有重要意义。同时香烟烟雾中也存在烟碱，检测并控制烟雾、空气、水等环境中的烟碱有利于提高公共安全。

烟碱由于吡咯环上的N连有一个甲基，属于叔氨型，易被质子化，因此烟碱溶液呈碱性，几乎可与任何酸生成盐，当遇到碱时会游离出烟碱，这成为早期烟碱提取和检测的重要依据［2］。早在20世纪前半叶，由于烟草制品的盛行及尼古丁的成瘾性危害，人们对于烟碱的检测进行了一定的研究工作。据文献［3］报道，1909年，Bertrand 和 Javillier采用硅钨酸重量法测定了烟碱，该法在碱性条件下对烟碱水溶液进行蒸馏，蒸汽中的烟碱被硅钨酸吸收形成硅钨酸盐沉淀［SiO2·12WO3·2H2O·2(C10H14N2)2·5H2O］，将沉淀灼烧后，根据剩余的无水硅酸残渣重量间接得出烟碱含量。1950年，Ogg等［3］在此基础上进行了优化。Markwood［4］于1939年公布了一种烟碱比色测定方法，用溴化氰或氯化氰将烟碱的吡咯环断开，之后与对氨基苯磺酸产生一显色化合物，测定该化合物的吸光度从而确定烟碱含量。这些方法虽简单，但测定结果为烟碱类植物碱总量，高于烟碱实际含量。随着研究的深入和分析仪器的进步，陆续发展了红外光谱法、极谱法、色谱法和电位法等更加准确的检测方法。

近年来，电子烟被视为减少吸烟者对香烟的依赖，有益社会公共健康的有效发明。电子烟液通常由保湿剂(主要是丙二醇和甘油)、调味剂和尼古丁组成，烟碱的含量直接影响电子烟的品质及安全性，因此烟碱的检测方法再次引起了关注［5］。由于含有烟碱的样品种类繁多且检测具有一定难度，近年来关于烟碱的检测方法报道较多，本文对烟草及生物样品中烟碱测定的样品前处理技术(固相/液相微萃取技术和分子印迹法)和常用的检测方法(分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、电化学法)进行了总结，并阐述了各种检测方法的特点和适用范围。

1 样品前处理

烟草中已知的生物碱有40多种，其中去甲烟碱、新烟碱等与烟碱有着极其相似的结构;而尿液、血液等生物样品中不仅含有与烟碱结构相似的代谢物，而且烟碱含量低微。尽管高灵敏度的检测器已经被开发出来，但面临装置复杂、成本较高等问题，发展简单有效的样品前处理方法对成功测定烟碱依然必要。检测烟碱时常用的前处理方法主要有索氏提取法、液液萃取法、超声/微波辅助提取法，本文只介绍近年来发展较快的两种新型前处理技术。

1．1 固相/液相微萃取技术

固相/液相微萃取技术(SPME/LIME)集采样、萃取和浓缩于一体，可高通量自动化制备样品，同时降低检出限。Lim等［6］建立了一种顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法，成功测定了283种调味液体、21种尼古丁液体和12种一次性电子烟液中14种挥发性有机化合物的含量，检出限大多在0.1～3 μg/L。采用固相/液相微萃取技术进行样品前处理近年来发展迅速，显著提高了烟碱检测的灵敏度。March等［7］以分散液-液萃取法为样品前处理手段，GC-MS为检测方法成功测定了茄子中的尼古丁，检出限为 0.4 μg/L。Mahpishanian 等［8］建立了一种基于氧化石墨烯的固相微萃取方法，测定生物样品和水中的尼古丁，检出限为1.5 μg/L。Boyacl等［9］采用具有2 mm×6 μm涂层的小型超薄SPME纤维，快速、高通量、非消耗的同时测定了血浆中的尼古丁、N，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺和双氯芬酸的含量，检出限为 5.0 μg/L。

1．2 分子印迹法

分子印迹技术(MIT)使用模板在大分子中形成特异性识别位点，利用洗脱模板后形成的特定空腔再次识别目标分子及其类似物，因分子印迹聚合物的稳定性和低成本，其一经发明即作为定制的分离材料被大量尝试应用于分析当中。目前，分子印迹与固相萃取(SPE)和SPME等技术结合用于食品、药物分析领域中的样品制备，具有更高的保留效率和更好的选择性，同时可以提高样品回收率［10，11］。近年来，烟碱分子印迹聚合物被证明对香烟烟雾［12］及水中的尼古丁［13］有良好的吸附能力，随后作为样品前处理手段成功应用于生物样品中烟碱含量的测定。Franqui等［14］在磁性纳米粒子表面上制备了烟碱分子印迹聚合物(MIP)，用于尿样中尼古丁和可替宁的分散固相萃取，通过GC-MS分析，检出限为0.1 μg/L。该方法使用外部磁场分离尿样与MIP，无需离心或过滤，操作简便迅速，由于MIP的稳定性还可获得较好的重复性。Ceglowski等［15］分别用尼古丁、异丙安替比林和对羟基苯甲酸甲酯作为模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂合成MIP，这些MIP被用作环境等离子体质谱法检测尿样和血浆中3种模板分子含量的选择性吸附剂，其中尼古丁的检出限为10 nmol/L，回收率可达96%。尽管在检测过程中MIP被破坏，无法重复使用，这种方法依然具有低成本优势，可满足简单高效分析低烟碱含量生物样品的要求。本课题组一直致力于MIT在天然产物提取方面的研究［16，17］，基于对近年来烟碱提取方法的考察，已经合成了烟碱MIP，将用于高纯度烟碱的制备。

2 样品分析

2．1 紫外分光光度法

由于酸性条件下烟碱水溶液在259 nm处具有最强紫外吸收，且吸光度与溶液浓度成正比。Willits等于1950年开发了紫外分光光度法检测烟碱粗提液浓度的检测方法，目前该法依旧用于工业检测［18］。王奕等［19］和陈丽金［20］均通过盐酸吸收蒸馏出的烟碱水蒸气，定容后在236 nm、259 nm和282 nm处分别测定吸光度，采用三点矫正法即可计算出烟碱溶液在259 nm的吸光度，进而测定烟碱含量。紫外分光光度法操作简单，检测时间短，能够快速评价烟碱的提取效果。缺点是容易受到与烟碱有相似紫外吸收光谱的植物碱、植物色素等干扰，精确度不高，仅适用于烟碱水蒸气中烟碱的检测。

2．2 络合分光光度法

烟碱可与一些化合物产生有色络合物，与传统紫外分光光度法相比，将络合物萃取后进行分光光度测定，可以有效减少干扰，提高灵敏度和准确度。常用的络合试剂是甲基橙，烟碱与甲基橙在pH=5时形成黄色络合物，经氯仿或二氯甲烷萃取后，在420 nm处测定其吸光度从而测定烟草中烟碱的含量［21，22］。该检测方法迅速简便，灵敏度与 LC-UV/PDA法相当，可检测常规烟草样品，但所用萃取剂毒性较大。朱泽华等［23］采用碘化钾为络合试剂，利用二溴化尼古丁在淀粉存在的条件下和碘化钾反应生成蓝色染料，成功测定了香烟、香烟烟雾、血样和尿样中的总烟碱和尼古丁含量，该法避免了有毒试剂的使用，结果准确可靠。此外，文献［24］以高锰酸钾为络合剂测定了香烟中的烟碱含量;文献［25］采用饱和苯胺及Br-SCN－作为双络合试剂，在458 nm处测定吸光度进而检测了尿液中的尼古丁。

2．3 液相色谱法

与紫外分光光度法相比，液相色谱法(LC)的检测结果更加准确，适用范围更广，已经成为目前国内外检测实际样品中烟碱含量最常用的方法。烟碱为二元弱碱，极性较强，液相色谱法一般采用反相C18柱或C8柱为固定相，极性有机溶剂/磷酸盐或乙酸盐缓冲液为流动相。由于烟碱在水溶液中以游离态的单质子态和双质子态存在，易与色谱柱上残余硅羟基的氢键键合，造成宽峰、拖尾等现象，通常需要添加三乙胺改善峰形［26，27］。另外，水相 pH 值的选择对成功检测烟碱尤为重要，pH=2.5～4.2［28－31］或pH=6.0 ～ 6.8［32，33］可以获得较好的检测结果。采用低pH值缓冲液时烟碱保留时间短，易形成对称尖峰，但需注意与干扰组分吸收峰的重叠;而选用pH=6左右的缓冲液时，烟碱保留时间略长，与其他物质分离良好，但拖尾现象较低pH值时严重。近年来发展起来的亲水色谱(HILIC)，由于其可在极性固定相上采用含水的极性溶剂洗脱进而分离极性或离子化目标物，流动相通常是高浓度的乙腈(60%～97%)/低浓度的水(40%～3%)，色谱柱具有低黏度和小背压的优点，在药物分析、生物医学和临床分析方面的大量应用引起了极大的关注［34］。Silva等［35］采用HILIC柱建立了室外公共区域三手烟中尼古丁含量的测定方法，流动相采用了乙腈-水(9∶1，v/v)，避免了缓冲液的使用，且无需添加三乙胺。

液相色谱法检测烟碱常用的检测器为紫外可见光检测器(UV/PDA)和质谱检测器(MSD)。LCUV/PDA法应用最广，已成功用于检测烟叶、烟草制品、尿液、血浆等样品中的烟碱含量，该法操作简单，重现性好，适用于大量常规样品的分析;缺点是对样品要求较高，样品前处理耗时长。Wang等［36］采用高通量动态微波辅助提取(HTDMAE)装置联用SPE法处理新鲜蘑菇中的烟碱，后采用LC-UV法检测，检出限为5.6 μg/kg，远低于欧洲食品安全局(EFSA)对蘑菇中尼古丁最大残余量36 μg/kg的要求。该方法可在9 min内同时处理20个样品，检测迅速，结果准确，可作为LC-UV法分析复杂固体样品中烟碱含量的参考方案。LC-MS/MS法既具有液相色谱的高分离效能，又有着质谱的高定性能力，被广泛用于代谢组学研究，与其他技术相比，具有更高的灵敏度和代谢物覆盖率。Siskos等［37］通过LC-MS/MS测量人体血清和血浆中的189种代谢物，精密度小于20%。该法大大降低了样品前处理的要求，尤其适用于生物样品中烟碱的含量测定［38－44］。Marclay 等［45］利用 HILIC-MS 法成功检测了72个尿样中的尼古丁和4种主要代谢产物的含量，样品只需要经过液液萃取(LLE)即可进行检测，检出限为500 pg/mL，该法已用于调查2009年冰球世界锦标赛期间运动员的吸烟情况。Abu-Awwad等［46］采用LC-MS法分别测定了人体血浆、精液和精子中尼古丁、可替宁和尼古丁N-氧化物的含量。此外，LC-MS/MS法还可用于检测电子烟液［47－49］中的烟碱。Aszyk 等［50］开发了一种以环磷酰胺为内标物的LC-MS/MS方法，该方法用于同时测定电子香烟液体中的烟碱和42种调味化合物，检出限范围在1～148 μg/L，为规范和监控电子香烟中的成分提供了便利。新的LC-MS/MS方法也用于测定普通烟草制品中的烟碱含量。Shifflett等［51］建立了一种超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法(UPLC-ESI-MS/MS)用于同时检测新鲜烟叶及烟草相关化学制品中烟碱、茄尼醇和烟草特异性亚硝胺等14种物质的含量，可获得高分离效率和低检出限。LC-MS/MS法精密度高，检测时间短，但由于操作复杂，成本高昂，应用受到一定限制。

2．4 气相色谱法

气相色谱法(GC)以气体为流动相，快速传递样品，使样品组分瞬间完成分离，是检测烟草及卷烟烟气中烟碱的常规方法，也用于生物样品(如血浆、尿液、头发)中烟碱的检测。氢火焰离子化检测器(FID)、氮磷检测器(NPD)和质谱检测器(MSD)是目前气相色谱法检测烟碱常用的检测器。

GC-FID法响应快、成本较低、灵敏度足以分析大多数烟草样品中的尼古丁。国标GB/T 23355-2009规定以高纯氮气或氦气为载气、正十七烷或喹哪啶为内标物、异丙醇为萃取剂，测定卷烟烟气总粒相物中烟碱的含量。此外，中华人民共和国烟草行业标准YC/T 246-2008同样采用GC-FID法测定烟草及烟草制品中的烟碱含量，规定以氦气或高纯氢气为载气，以喹啉为内标物，以甲基-丁基醚为萃取剂;或以正十七烷或喹哪啶为内标物，以正己烷为萃取剂。采用 GC-FID 法检测头发［52］、尿液［53］、戒烟保健品［54］及电子烟烟液［55，56］中的烟碱也屡见报道，该方法具有分析时间短，结果准确等优点，但样品前处理较为复杂。

GC-NPD较GC-FID增加了一个热离子源(由铷盐珠构成)，对含氮和含磷化合物的离子化效率大为提高。GC-NPD法目前集中用于检测烟草中的烟碱，由于对含氮化合物具有强选择性，因此可同时测定烟草中的多种生物碱，具有分离效率高、检测速度快等特点。Yang等［57］对已有的GC-NPD法进行优化，可同时测定新鲜烟叶或烤烟叶中包括烟碱在内的5种生物碱含量，该方法被证明适用于烟草样品中生物碱的常规分析。

GC-MS法基于质谱的高定性能力，较前两种方法更为灵敏，样品前处理简单，已经逐步取代GCFID/NPD法在检测烟草样品中烟碱含量的应用［58－61］。师君丽等［62］采用 GC-MS 法同时测定香烟、白肋烟和烤烟样品中8种生物碱的含量，选择性好、回收率高，适用于同时测定烟草中含量差别大且有些含量低微的生物碱。此外，GC-MS法也用于血浆中烟碱含量的测定。20世纪末，已有国外学者以索氏提取法为样品前处理手段，采用GC-MS法检测人体血浆中的尼古丁，检出限低，但精密度受浓度影响波动较大［63］。近年来，国内学者分别以二苯胺［64］或茴香脑［65］为内标物建立了检测鼠类血浆中烟碱含量的GC-MS法，探究尼古丁在动物体内的药代动力学特点。该法特异性强、操作简便、精密度好。随着安全意识的不断提高，人们逐渐重视非烟草类植物及水中的烟碱含量。Lozano等［66］分别采用LC-MS法和GC-MS/MS法检测蘑菇中的尼古丁，检出限为 0.7 μg/kg。Dobrowska 等［67］建立了一种LLE-GC/MS的方法检测自来水、废水和唾液中的烟碱含量。通过液液萃取富集样品中的烟碱，以萘为内标物，精确、简便地检测烟碱，检出限为2.6 μg/L。Moldoveanu 等［68］应用 GC-MS/MS 方法测定了烟碱含量在十亿分之几范围内的茄科和其他几种常见蔬菜中的烟碱水平，检测到的最小含量为1.9 ng/g(干基计)。GC-MS法具有极低的检出限，操作简单，成本低于LC-MS/MS法，是分析含有痕量尼古丁且基质复杂样品的首选检测方法。

随着联用技术的发展，气相色谱耦合离子阱质谱检测(GC-IT-MS)和二维气相色谱-氮化学发光检测器(GC×GC-NCD)分别用于屋尘中有机氮致癌物的测定，包括尼古丁、4种芳香胺、2种硝基化合物、8种N-亚硝胺和2种烟草特有的亚硝胺［69］。实验证明，对于衍生化的芳族胺，GC-IT-MS有更高的选择性和灵敏度;而GC×GC-NCD的优势在于不需要衍生化即可确定这些不同种类致癌物的含量。

2．5 毛细管电泳法

20世纪 80年代，Jorgenson等［70］报道了使用毛细管区带电泳法分离氨基酸和多肽的研究。与LC-UV/PDA法相比，毛细管电泳法具有样品用量少、快速、高效等特点，但由于其毛细管直径小，光路太短，采用紫外检测时其灵敏度较低，另外电渗流现象也会影响其分离的重现性。［71，72］。

目前，毛细管电泳法用于烟碱含量的测定主要集中于烟草及烟碱制品，随着多种高分离效率并高灵敏度的检测器在毛细管电泳中的应用，未来有望实现在更多样品中的检测。Marsh等［73］分别采用微乳液毛细管电动色谱、非水毛细管电泳和自由溶液毛细管电泳测定了尼古丁锭剂中的烟碱和5种相关生物碱的含量，3种方法均能成功地对6种目标物进行定性定量分析，且测定结果与高效液相色谱结果一致。赵利敏等［74］建立了一种毛细管电泳-电化学发光联用方法检测烟草中的尼古丁，检出限为0.5 μg/L，高于 UV检测器的灵敏度。Lochmann等［75］采用毛细管电泳-紫外检测法直接测定烟草植物表皮细胞内的烟碱、去甲烟碱和赤藓红素，检出限为0.013 pmol，该法简化了样品前处理步骤，可快速准确地测定烟草中的烟碱含量。近年来，毛细管电泳通过与高灵敏度的检测器联用，检出限可以控制在μg/L水平。对于较复杂的烟碱样品来说，毛细管电泳法在简化样品前处理而不影响检测效果方面具有明显优势。

2．6 电化学法

电化学分析法是以电化学原理为基础，利用被分析溶液的组成及含量与其电化学性质相对应而建立起来的一类分析方法。该方法检测过程简便迅速，便于自动化，在微量分析、动态分析等领域有着广阔的发展前景。电极改性剂是影响电化学感应器性能的关键因素，目前已有多种电极改性剂被应用于尼古丁电化学传感器的制作，主要有氧化石墨烯(RO)修饰电极［76］、还原氧化石墨烯(RGO)修饰电极［77，78］和碳糊(CPE) 修饰电极［79，80］。RO 制作方法成熟，具有较高的比表面积，表面丰富的官能团使其可与金属盐形成稳定复合物以增强催化性能和灵敏度，但还未有检测实际样品的报道;RGO经金纳米粒子修饰后用于香烟及戒烟咀嚼片中烟碱含量的测定，样品前处理简单，检出限为 0.015～0.12 μmol/L，缺点是RGO容易发生不可逆的自发团聚从而降低修饰电极性能，常采用涂层法增强稳定性;CPE经纳米碳管或Nano-TiO2修饰后不仅可以检测香烟中的烟碱，还可检测生物样品(尿液、血浆)中的尼古丁含量，检出限为0.01 μmol/L。电化学法装置简单，成本低廉，检测方法迅速直接，基本不需要有机溶剂，可作为绿色烟碱分析方法，但不适用于批量烟碱样品的检测。

3 结论和展望

烟碱作为评价烟草及其制品的重要指标，其在烟草样品中的检测技术由来已久且已趋于成熟。近年来，随着电子烟的兴起以及人们对食品和环境中烟碱安全性的重视，烟碱含量测定有了新的条件和要求。液相色谱法作为最经典的烟碱检测方法，基本可以满足包括烟草、烟碱制剂、血浆、尿样在内的常规样品的检测。气相色谱法作为测定烟气总粒相物中烟碱含量的标准方法，与质谱联用适用于样品前处理复杂、对灵敏度要求极高的情况。毛细管电泳法可与多种检测器匹配，未来可发展为检测生物样品中烟碱含量的绿色方法。烟碱检测手段不断发展和完善的同时，依然存在着一些问题，例如样品前处理中大量溶剂的使用、高灵敏度检测器带来的高成本和装置复杂的问题，因此，未来需要发展更加绿色、精简、成本低的烟碱检测方法。