细胞内Ca2+及其在卵母细胞成熟中的作用

马薇薇，蒋春艳，崔毓桂

(南京医科大学第一附属医院生殖医学科，南京 210029)

细胞生物学中普遍存在Ca2+介导的胞内信号传导模式，由细胞内Ca2+浓度和空间分布的变化构成。Ca2+参与调控机体几乎所有的生物学功能，诸如心脏和肌肉收缩、神经信息传递、胚胎形成和发育、细胞增殖和凋亡、细胞能量代谢等等。但长期的细胞内高Ca2+具有细胞毒性，可触发细胞死亡。因此，波、尖峰或震荡形式的钙信号必须受到严密的调控。多种多样的离子通道、离子泵以及转运体的协同工作，形成了细胞膜内外和细胞器内外陡峭又严格受控的Ca2+浓度梯度[1]。卵母细胞成熟是细胞周期的转化过程，受到Ca2+的严密调控。Ca2+促使卵母细胞从减数分裂阻滞期恢复，从而促进卵母细胞成熟。

一、细胞内钙的调节

细胞质内Ca2+浓度维持约100 nmol/L，这是胞内钙信号的背景基础。胞外Ca2+浓度约为1～2 mmol/L，细胞内Ca2+储存库(主要是内质网)中的Ca2+浓度在250～600 μmol/L。钙信号产生是由于细胞外Ca2+的内流，或是细胞内的Ca2+库外流。内质网和质膜上的通道和钙泵相互协作，调节内质网和细胞质中的钙稳态[1]。

1.细胞膜的钙调节：细胞膜主要的Ca2+通道包括瞬时感受器电位通道(transient receptor potential，TRP)、电压门控钙通道(voltage-gated calcium channel，VGCC)和库控钙内流(store-operated Ca2+entry，SOCE)。它们介导细胞外Ca2+流入细胞质，而钠钙交换体(Na+/Ca2+exchange，NCX)、Ca2+-ATP酶等转运蛋白则负责将Ca2+移出细胞[2]。

TRP通道在各器官分布广泛，对Na+、K+和Ca2+都有通透性。对Ca2+的通透性会因亚型不同而有很大差异，按照基因同源性可以分为6个家族。TRP通道可被多种因素调节，如温度、渗透压、pH 值、机械力、配体等[3-4]。

VGCC对脑、骨骼肌、心肌、平滑肌、内分泌腺以及其他可兴奋细胞的生理功能至关重要。这些膜蛋白将细胞膜去极化信号转换为快速、局部的胞质钙浓度变化，继而触发分泌、收缩、迁移和基因转录等关键生物学事件[3-4]。

当内质网中的钙储量下降时，Ca2+可以从细胞外进入细胞，这一过程称为库控钙内流。它的机制主要涉及细胞膜上的钙释放激活的钙通道蛋白1(ORAI1)和内质网上的基质相互作用分子1(STIM1)。机制在内质网钙调节时详述[3-4]。

细胞质中低浓度的Ca2+主要由Ca2+-ATP酶维持。它们迅速地将胞内Ca2+泵回到细胞器内(如内质网)，或泵出到细胞外空间。这些Ca2+-ATP酶根据其亚细胞定位，可进一步分为三个亚型：质膜Ca2+-ATP酶(PMCA)、内质网/肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA)和高尔基体、高尔基体的囊泡分泌途径Ca2+-ATP酶(SPCA)。每个亚型包含多个异构体和剪接变异体，其表达、调节和动力学特性皆呈现组织特异性。因此，Ca2+-ATP酶有助于形成一个高度复杂而精细的细胞内Ca2+信号网[1-2]。

2.内质网钙的调节：细胞内Ca2+高度集中在内质网中，它不是简单的储存场所，而是一个动态的存储场所，它通过释放或吸收钙来对电和化学刺激作出反应，从而有利于快速的生理性钙信号介导。而Ca2+耗竭既是内质网应激的原因，也是内质网应激的结果。内质网主要通过雷尼丁受体(RyR)和1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)释放Ca2+[5]。内质网Ca2+耗竭时，由肌浆网/内质网Ca2+-ATP 酶(SERCA)和基质相互作用分子1(STIM1)维持细胞内钙稳态[6-7]。

RyRs是位于肌浆网/内质网膜的Ca2+通道，主要在可兴奋细胞中表达。在肌肉中，通过开启肌浆网的RyRs，Ca2+才得以释放。哺乳动物有三种不同亚型的RyRs，但没有一个是完全特异性的亚型。RyR1主要表达于骨骼肌，骨骼肌肌质网上的RyR1与细胞膜二氢吡啶受体(DHPR)分子间相互作用，当动作电位引起细胞膜去极化，DHPR的构象变化激活RyR1 产生电压依赖性钙释放；RyR2主要表达在心肌，心肌细胞兴奋前，首先通过L型Ca2+通道使细胞外少量的Ca2+内流，内流的Ca2+诱导肌浆网内Ca2+通过RyR2释放至胞浆中，此过程称之为Ca2+诱导的钙释放；RyR3主要表达在大脑和横膈，也是通过Ca2+诱导钙释放的方式激活[8-9]。

IP3R是一个专门的受体门控钙通道，通过1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和钙调节Ca2+浓度。IP3Rs主要在非兴奋性细胞如血管平滑肌和呼吸平滑肌中表达。当IP3与IP3R 结合，使通道开放，将Ca2+释放到细胞质中，而这一过程进一步激活IP3敏感的钙库释放Ca2+。该反应导致局部Ca2+增加，促进钙结合在IP3R第二位点，使IP3R通道失活，终止钙的释放。肌浆网中Ca2+减少也有助于终止Ca2+的释放[3，8]。

STIM1是肌浆网的膜蛋白，作为Ca2+传感器，向质膜Ca2+通道传递信息。当内部存储的Ca2+下降时，STIM1可形成点状结构聚集在肌浆网上，并促使肌浆网靠近质膜，与细胞膜上的钙释放激活的ORAI1相互作用，使得Ca2+进入细胞内[3，7]。而SERCA作为内质网/肌浆网主要的钙泵，每水解1分子ATP，将从胞浆运输两个Ca2+到内质网，因此通过ORAI1进入细胞质的Ca2+，被SERCA回收到内质网中。鉴于SERCA泵对钙代谢的重要性，它们的活动受多层次的严格管制，包括基因转录、蛋白表达、与内源性蛋白的相互作用，以及各种翻译后修饰[8]。

3.线粒体的钙调节：线粒体与内质网之间有紧密的物理联系，称作线粒体-内质网结构偶联。它的主要功能是调控脂质转运和控制细胞钙信号。为了摄取钙，线粒体必须暴露于高钙浓度，此过程最有可能发生在内质网附近。在接触部位，Ca2+直接从内质网转移到线粒体，控制关键的线粒体功能，如凋亡和生物合成。此外，线粒体对Ca2+的摄取也参与了钙信号的转导，并可防止细胞质内Ca2+的过度升高[10-11]。

线粒体是细胞内的钙缓冲区，缓冲质膜和内质网的Ca2+流，从而维持钙稳态。干扰这种钙缓冲活动将导致胞内钙异常增加，可激活不同的信号通路，包括钙和钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶Ⅱ型(CaMKⅡ)，导致卵母细胞周期改变。细胞质的Ca2+可以通过线粒体外膜电压依赖的阴离子选择性通道(voltage dependent anion-selective channel，VDAC)，先通过线粒体外膜，再通过线粒体内膜依赖单向吸收体(mitochondrial calcium uniporter，MCU)将Ca2+转运至线粒体内部。而线粒体内累积的Ca2+最终将通过钠钙交换体和氢/钙转运蛋白移除[9，12]。

VDAC蛋白是线粒体外膜通道中最丰富的蛋白。它们调节线粒体内外呼吸代谢物的运输，并且广泛参与调节代谢物和活性氧自由基(ROS)水平以及内质网和线粒体之间的信号传导。在哺乳动物中，VDAC有三种同种型，由位于不同染色体上的不同基因编码。进化最早的同种型是VDAC3，而VDAC1是最主要的。所有的同种型都在哺乳动物线粒体中普遍表达，但在物种间有差异，而个体的表达水平在不同组织之间也有变化。细胞VDAC位于外线粒体膜中，所有三种同种型都与线粒体结合内质网膜(mitochondria-associated ER-membrane，MAM)密切相关。许多蛋白质组学研究的发现表明，所有的同种型都可能参与线粒体-内质网结构偶联。VDAC2在HL-1细胞的肌浆网/线粒体结上与RyR2物理相互作用，以产生对线粒体Ca2+摄取至关重要的Ca2+微域[9，12]。

MCU的主要成分仍然未知。作为线粒体内膜摄入Ca2+的唯一来源，MCU对Ca2+具有低亲和力。这一特性可以解释为线粒体通常紧邻内质网/肌浆网膜中IP3R或RyR Ca2+的出口处，能够感测具有高Ca2+浓度的微区域，因而补偿了MCU的低亲和力。这种机制可以控制线粒体膜上的Ca2+运输，并阻止线粒体Ca2+过载[12]。

4.细胞内钙结合蛋白：Ca2+可以直接传递信息，也可以结合酶位点，并升高或者降低酶的活性。但是，在大多数情况下，Ca2+并不直接传递信息。Ca2+信号不同的振幅、频率和位置可编码多种信息，这些信息可以由钙结合蛋白破译。钙结合蛋白是能够与Ca2+特异性结合的一类蛋白质的总称，具有EF-手的结构特征。EF-手结构是Ca2+结合区，每个EF-手有两个Ca2+结构域，可以各结合一个Ca2+。迄今为止发现了超过800种钙结合蛋白，其中，有100多种蛋白的三维立体结构被揭示。然而，它们精确的功能依然未知。重要的钙结合蛋白都是EF-手结构蛋白，如钙调蛋白(Calmodulin)、肌钙蛋白C(troponin C)、恢复蛋白(recoverin)、S-100、STIM(基质相互作用分子)，它们都结合Ca2+并传递信号。其他EF-手结构蛋白，例如小清蛋白、钙视网膜蛋白可以维持Ca2+的动态平衡。这些蛋白质大多含有偶数个的(在2～12之间)EF-手结构[13]。

在进化中，钙调蛋白(CaM)是最为保守的EF-手结构蛋白。它广泛存在于所有真核生物中，且在所有脊椎动物中的编码序列是100%相同的。在人类中，它由三个非等位基因编码，但尽管蛋白质结构相同，编码序列却差异很大。CaM的外形类似哑铃，有2个相似的球形末端，中间是长的灵活的螺旋结构，且EF-手结构易于成对出现。当CaM与Ca2+结合后，CaM出现构象的改变，暴露蛋白表面的疏水区，与靶蛋白亲和性增强，能迅速与靶蛋白结合，调节细胞功能[13-14]。

STIM是内质网膜上的蛋白质，能探测到内质网内的Ca2+的浓度。STIM的EF-手结构是不寻常的，它由典型的和非典型的EF-手结构组成。EF-手结构可结合Ca2+，但非典型EF-手结构中对Ca2+至关重要的氨基酸被替换，影响了与钙的结合，因此在内质网的Ca2+呈现高浓度时，STIM与Ca2+的亲和力比CaM和其他EF-手结构蛋白质低3个数量级。当钙库消耗后，Ca2+又从STIM分子的EF-手结构域中解离，STIM的构象改变，与细胞膜上的ORAl1蛋白结合，在内质网与细胞膜之间形成连接，激活钙通道的开放[11]。

S-100蛋白家族是也是含EF-手的蛋白质家族，因在饱和硫酸铵溶液中可溶而得名。到现在，在人类已经确定21种S-100蛋白。他们很小，通常包含两个EF-手，在C-末端是典型的EF-手结构，而N-末端的是一个伪EF-手结构，其中14号残基与Ca2+结合的亲和力很低。这些蛋白质也结合其他的二价金属离子如锌和铜，并且通常是以同源二聚体形式出现。它们调节许多细胞功能，如转录、细胞周期、细胞生长、运动、分化。除了金属离子，其中一些也与目标蛋白例如细胞外的RAGE(晚期糖基化终产物受体)结合。目前尚不清楚它们是主动分泌还是被动释放到细胞外。一些S-100蛋白表达的失调会导致不同的疾病表型，包括癌症[15]。

二、Ca2+的细胞生物学作用

“第一信使”与质膜受体的相互作用，是传递信息给细胞的典型方式，而随之激活扩散的“第二信使”，又将信息传达到目标细胞。Ca2+就是可扩散的第二信使之一。然而，Ca2+也可以作为第一信使直接进入细胞，将信号携带到细胞靶点，与质膜受体的相互作用。而在更多的细胞中，Ca2+则会作为第一信使，与典型的质膜受体结合，触发第二信使IP3的形成。Ca2+被第二信使IP3释放到胞质中，称之为“第三信使”更为正确[16]。

已知Ca2+是体内重要的信号分子，调控许多信号通路。在线粒体中，Ca2+的主要任务是调节ATP的产生。Ca2+依赖性磷酸酶激活丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶，加速三羧酸循环，生成烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)，这些电子载体为电子传输链提供动力，最终产生ATP[17]。

线粒体内钙超载，尤其是伴随着氧化应激时，可能会导致线粒体损伤，最终造成细胞死亡。这种钙超载引起的细胞病理的发生是由于线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的持续开放，mPTP是线粒体内膜一种非特异性孔隙，可通过分子量高达1.5 kDa的分子。mPTP持续开放使得线粒体内膜Ca2+内流的驱动力消散，减少氧化磷酸化和ATP的合成。此外，高胶体渗透压还会导致线粒体基质肿胀、嵴断裂展开、内膜断裂，接着通过凋亡或坏死引起细胞死亡[17-18]。

钙信号传导在哺乳动物的整个细胞周期中都起着关键作用。在G1期、G1/S转换和有丝分裂期间，细胞内的钙浓度在不断变化。在G1早期，钙对于FOS、JUN和MYC等基因的表达以及后来的RB磷酸化反应都很重要。而加入钙调素拮抗剂在G1中触发细胞周期停滞。钙调蛋白的下游靶标钙调蛋白激酶(CaMK)和钙调神经磷酸酶是细胞周期蛋白D1表达所必需的。钙/钙调蛋白通路还可调节几种转录因子，如NFAT(活化T细胞核因子)或cAMP反应元件结合蛋白(CREB)，靶向控制细胞周期从G1进展到S，其中CREB可通过钙通路被CaMKⅡ和CaMKⅣ诱导磷酸化。磷酸化的CREB与目标基因如细胞周期蛋白 D1启动子上的cAMP应答元件(CRE)结合，从而激活转录[19]。

三、卵细胞中的钙作用

Ca2+在哺乳动物卵母细胞生理调节中发挥着重要作用。在卵母细胞的成熟过程中，细胞周期会经历双线期、MⅠ期和MⅡ期阻滞[20]，而钙震荡则使卵母细胞重新进入减数分裂周期。卵母细胞的胞外介质和/或内质网被触发从而释放Ca2+，激活CaMKⅡ，诱导ROS生成。CaMKⅡ激活、生理范围内活性氧ROS水平的升高和cAMP水平的降低直接或间接触发成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)失衡。不稳定的MPF最后诱导哺乳动物卵母细胞减数分裂从双线期、MⅠ期和MⅡ期的阻滞中恢复[21]。

在卵母细胞受精的过程中，需要Ca2+震荡信号维持正常受精完成、启动胚胎发育信号并维持正常的胚胎发育。Ca2+被释放到卵母细胞内的确切机制尚未阐明，如今，精子因子假说已得到普遍接受。精子因子(sperm factor，SF)，如磷脂酶C(PLCζ)或后顶体鞘WW结构域结合蛋白(post-acrosomal sheath WW domainbinding protein，PAWP)，扩散到胞质启动分子级联反应，该反应主要涉及肌醇磷脂途径。受精时，PLCζ释放到胞质，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(hydrolyzes phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2)，生成IP3。IP3与IP3R结合，触发内质网储存的钙释放。PAWP似乎可与卵母细胞性YAP蛋白(yes-associated protein)结合，最后激活磷酸肌醇信号转导通路。精子因子的作用导致周期性波样短暂的钙释放，从而产生皮质颗粒的胞吐作用，激活卵母细胞，信号转导级联使得卵母细胞受精，转换成二倍体胚胎[22]。

在卵母细胞成熟和激活的过程中，Ca2+震荡有着重要的作用，因此维持其在卵母细胞内的稳态是至关重要的。其调控机制主要包括STIM1、ORAI1、SERCA和PMCAs。STIM1作为低钙水平传感器，发生改变或不足均可能导致卵母细胞的激活不足，它是精子激活的卵母细胞激活因子(SOAF)触发生成Ca2+震荡的关键。当PIP2水解为IP3和DAG，IP3与内质网膜上的IP3R结合，这将导致IP3R通道开放，使钙流出内质网管腔。位于内质网腔的STIM1感受内质网Ca2+浓度降低后，将使STIM1从内质网膜重新定位到质膜，与ORAI1通道直接相互作用。此通道随后打开，并允许钙进入细胞。当内质网中Ca2+浓度正常时，STIM1与ORAI1分离，阻止Ca2+内流。除了STIM1和ORAI1，SERCA和PMCAs也参与钙平衡。SERCA位于内质网膜，将胞浆Ca2+泵到内质网管腔。细胞外Ca2+通过ORAI1和其它膜通道蛋白进入细胞质后，被SERCA泵入内质网中。这使内质网的Ca2+得以补充，而后IP3再与其受体相互作用，从而产生另一个Ca2+震荡。PMCAs是位于质膜而不是内质网的钙泵，可将Ca2+从胞外空间泵送到细胞质中。目前，尚不清楚SERCAs和PMCAs的改变是否有可能损害卵母细胞激活的能力。这些蛋白同时作用，使得卵母细胞的Ca2+维持稳态，保证Ca2+信号的传递和卵母细胞的激活[23]。

四、IVM中Ca2+的作用

体外成熟(IVM)是指从对窦卵泡提取未成熟卵母细胞，并在实验室条件下培养成熟的方法。IVM可以减少激素类似物的使用，消除卵巢过度刺激综合征(OHSS) 和可能的长期并发症，如激素依赖性肿瘤包括乳腺癌和卵巢癌等，具有一定的临床优势[24]。然而，迄今为止，使用年轻女性的卵母细胞获得的临床妊娠率仍较低[25]。卵母细胞成熟是一个长期的过程，包括细胞核和细胞质成熟。细胞核成熟主要涉及染色体分离，以出现两个极体为成熟的标志。细胞质成熟主要涉及细胞器的重新分布以及mRNA、蛋白质和转录因子的存储，以备卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育之用[5]。细胞质成熟十分复杂，目前仍然有许多研究存在争议。IVM在诱导减数分裂核成熟方面简单方便，但在诱导适当的细胞质和分子成熟方面则较为复杂，而这对卵母细胞成熟却是必不可少的[26]。

在IVM取卵过程中，卵母细胞从卵泡环境中取出时，cAMP浓度急剧降低，卵母细胞减数分裂自发恢复，导致细胞质的不完全成熟。细胞质和细胞核成熟的不同步，将影响卵母细胞的发育和胚胎质量。通过药理学方法抑制减数分裂一直是许多研究者的努力，其中一些药物靶向作用于cAMP通路，如cAMP调节剂双丁酰环腺苷酸(dbcAMP)、磷酸二酯酶抑制剂西洛酰胺(cilostamide)、腺苷酸环化酶的刺激剂福司考林(forskolin)等。这些药物的目的是为了保持高浓度的cAMP，防止体外卵母细胞核过早成熟，从而提供足够的时间使得卵母细胞的核和胞浆成熟同步。但这些卵母细胞在处理之后，发育能力通常低于在没有抑制的情况下培养的卵母细胞[27]。而另一种方法则是调节钙的信号通路。在真核生物中，MPF是最重要的调节减数分裂细胞周期进程的因子，而Ca2+是卵母细胞中重要的信息传递分子，细胞内Ca2+水平增加，将通过CaMKⅡ激活MPF，使细胞核减数分裂继续进行。使用药物诱导Ca2+从内部存储释放，也可引发体外培养的小鼠、大鼠、牛、猪和人类卵母细胞减数分裂的自发恢复。而早在 1992年，科学家们就已经发现使用BAPTA螯合Ca2+，可以阻止小鼠卵母细胞过早活化的迹象[28]。使用Ca2+通道阻断剂(维拉帕米和硝苯地平)也能抑制体外培养的小鼠、大鼠、猪和牛卵母细胞减数分裂自发恢复。因此在IVM培养基中添加Ca2+抑制因子，通过阻断细胞内Ca2+的水平增加从而阻断MPF的激活，也可以防止卵母细胞核的早熟。

由此可见，对于IVM卵母细胞核与胞浆成熟不同步的问题，使用Ca2+通道阻断剂是一种很有潜力的解决方案。现在常规使用的IVM培养基都是基础培养基，如TCM-199 medium、Ham’s-F10 medium和Chang’s medium，用碳酸氢盐和/或HEPES缓冲，并辅以各种血清促性腺激素(FSH、LH)、生长因子和激素，并没有重视培养基Ca2+水平及其对于卵母细胞的重要作用[29]。目前发现在囊胚培养基中添加乳酸钙，似乎对线粒体的功能有积极的作用[30]。但IVM培养基内是否要添加、它的浓度是多少，现在尚未可知。同时IVM过程中，细胞在具有5%二氧化碳(CO2)和约20%大气氧气(O2)浓度的细胞培养箱中培养，但是动物体内的氧分压远低于大气氧分压。细胞暴露于高氧水平能够增加ROS的产生，可以引起细胞损伤，降低卵母细胞及其胚胎的发育潜能。同时ROS还会调节细胞膜和细胞器的钙离子通道，改变细胞内的钙分布，从而激活细胞核的成熟[31]。现在已经发现的抗氧化剂，如槲皮素、维生素C和白藜芦醇等，均可降低体外成熟卵母细胞中的细胞内ROS水平，提高胚胎数量和质量[32]。

五、总结和展望

Ca2+信号的传导影响细胞生命和死亡的各个方面。在所有生物体内，Ca2+是受到最严密调控的离子，细胞膜和细胞器上存在多种通道的调节，严格调控胞内和细胞器中的Ca2+水平。Ca2+结合成千上万的蛋白质，以影响它们的定位及功能。在卵母细胞成熟中，必须强调钙信号的发生以及对卵母细胞的影响，以阐明钙震荡在卵母细胞成熟和发育中中的必要作用。对卵母细胞成熟过程中钙调节的研究，有助于了解卵母细胞及胚胎的发生发展机制。卵母细胞成熟异常所导致的受精异常和不受精是IVM成功率低的重要原因之一。目前，为改善IVM中卵母细胞核和细胞质成熟不同步的问题，研究大多集中在阻止cAMP急剧降低，但成功率并没有显著提升。而1992年科学家就发现Ca2+螯合剂能阻止减数分裂自发恢复，防止卵母细胞核过早成熟，从而为细胞质成熟提供时间。所以，研究Ca2+在卵母细胞成熟的作用机制，对理解人类卵细胞的发育机制至关重要，该研究的结果将为IVM及体外受精-胚胎移植(IVF-ET)等提供新的理论依据，从而改善卵子质量，提高IVM的成功率。

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