HPLC法同时测定不同产地五味子中5种木脂素类成分的含量

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill的干燥成熟果实，主产于辽宁省，吉林、黑龙江产量也相对较大,临床用于治疗久咳虚喘、心悸失眠、盗汗、津伤口渴等症[1]。木脂素类化合物是五味子中含量较高且具有显著生物活性的成分[2]，药理作用显著，其单体和总木脂素已经广泛应用于在对抗炎症[3]、肝损伤修复[4]、肿瘤的预防和治疗[5]等方面。本研究建立HPLC同步测定5种木脂素类化合物含量的分析方法，对五味子药材的质量进行了分析与评价，以期为五味子药材及复方制剂的质量评价和监管提供一定的参考依据和数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(Agilent科技有限公司)；AR2140型电子分析天平(上海奥豪斯公司)；METTLER AB135-S十万分之一电子天平(瑞士)；FW-80 型粉碎机；KQ-250D型数控超声波清洗器。

1.2 材料 五味子药材共29批，经辽宁中医药大学张慧教授鉴定，均为正品，药材具体信息见表1。甲醇为分析纯；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。五味子醇甲(批号：Y17M8H31887)、五味子醇乙(批号：P28S6F3984)、五味子甲素(批号：Z23J7B16583)、五味子乙素(批号：P25M7F11829)、五味子丙素(批号：P28J8F36961)等均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。

表1 五味子药材样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：菲罗门XB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱条件为0～10 min，A为50%；10～15 min，A为50%～75%；15～25 min，A为75%；25～30 min，A为75%～50%。流速：1.0 mL/min；检测波长：217 nm；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃，色谱图如图1～2所示。

2. 2 混合对照品溶液制备 分别精密称取各对照品适量，甲醇超声溶解，得对照品浓溶液。精密吸取一定量的各对照品浓溶液，加甲醇稀释成含五味子醇甲(0.2048 mg/mL)、五味子醇乙(0.0493 mg/mL)、五味子甲素(0.0984 mg/mL)、五味子乙素(0.0463 mg/mL)、五味子丙素(0.01056 mg/mL)的混合对照品储备液，备用。

2.3 供试品溶液制备 五味子药材粉碎，过50目筛，取粉末约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，拭干锥形瓶表面放凉，称重，甲醇补足减失的重量，静置，取上清液，以0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密移取混合对照品储备液0.1、0.25、0.5、0.75、1 mL，置1 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密吸取各混合对照品稀释液及各单个对照品溶液(样品中5种木脂素类化合物含量差异悬殊，仅以稀释后的混合对照品溶液无法满足整个线性范围，因此各成分的最高浓度采用单标试验)各10 μL，注入液相色谱仪，检测，以对照品的进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，进行线性回归。具体见表2。

表2 5种木脂素类成分的线性关系结果

成分线性回归方程r线性范围/μg 五味子醇甲Y=6311.5X+55.16110.2048～2.56五味子醇乙Y=6497.8X-13.7070.99990.0493～0.61625五味子甲素Y=6569.5X-20.1640.99990.0984～1.23五味子乙素Y=7159.9X-11.6050.99990.0463～0.57875五味子丙素Y=5931.2X+9.30240.99980.01056～0.132

2.4.2 精密度实验 精密吸取混合对照品储备液10 μL，依色谱条件连续进样6次，进行测定，根据峰面积，计算得5种木脂素类成分的RSD分别为0.95%、0.64%、0.79%、1.6%和1.2%，符合规定，仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验 取同一批次五味子药材粉末6份(辽宁1批)，各约0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依色谱条件进行测定，根据5种木脂素类化合物的峰面积，计算其在样品中含量的RSD，分别为1.43%、0.52%、1.24%、1.85%、2.1%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性实验 取五味子药材粉末(辽宁1批)约0.5g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依色谱条件进行测定。分别于0、2、4、6、8、12 h各进样10 μL，得峰面积，并计算各成分峰面积的RSD，分别为0.27 %、1.35 %、0.8%、1.64%、2.2%，说明供试品溶液在12 h 内稳定，满足含量测定要求。

2.4.5 加样回收率实验 取已知含量的同一批五味子药材粉末(辽宁1批)约0.25 g，精密称定，共6份，分别加入对照品适量，依法制备供试品溶液，依色谱条件进行测定，计算5种成分的平均回收率及RSD，结果显示，5种木脂素类成分的平均加样回收率均在99%～100%之间，RSD均小于2%，符合相关规定，表明方法的准确度良好。具体见表3。

表3 5种木脂素类成分的加样回收率试验结果

2.5 样品含量测定 取各批次的五味子药材(过50目筛)约0.5 g，精密称定，各2份，依法制备供试品溶液，依色谱条件进行测定，得各化合物的峰面积，根据外标法中的线性回归方程方法计算样品中5种木脂素类成分含量。结果见表4。

表4 五味子中5种木脂素类成分含量 (n=2，mg/g)

3 讨论

本实验对多个色谱条件进行考察，包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水，3种梯度洗脱的流动相条件，最终确定乙腈-水的梯度洗脱为本实验选择的色谱条件，主要优点是在该色谱条件下样品中各被测成分的色谱峰与相邻成分均实现基线分离，色谱峰对称性良好，且分析时间快，仅需30 min就可以完成整个含量测定过程。同时也考察了不同柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、不同检测波长(217 nm、254 nm)对实验结果的影响，结果表明柱温对待测成分的色谱峰的分离度有影响，当柱温为30 ℃时，分离度最佳；以254 nm作为检测波长时，各色谱峰峰形变差，且因各批次药材中五味子丙素含量均较低，紫外吸收弱，色谱峰响应效果不理想，故选择色谱峰响应效果、峰形均良好的217 nm作为检测波长。

在前期材料的准备过程中，药材均产自五味子的主要产区：辽宁、吉林、黑龙江，29批药材大部分均收集自东北地区具有代表性的沈阳、哈尔滨的药材市场，以及在全国具有知名度的亳州、安国药材市场，既确保了药材产地的道地性和科学性，又收集了足够多的样品，确保了实验数据的真实、可靠、有代表性。同时对五味子药材的产地加工、仓储以及非产地加工、仓储对药材质量的影响进行了初步探索，并提供了一定的数据支持。

从表2中可以看出绝大部分样品中五味子醇甲的含量均≥4 mg/g，符合药典要求，但是在辽宁、吉林、黑龙江各批次当中各有1批、1批、2批药材的五味子醇甲含量未达到药典要求，对这4批药材研究发现，药材生产日期均明显早于其它批次，药材市场及饮片加工企业在五味子药材储藏过程中，出于成本的考虑，仓储条件可能无法达到国家规定，随着仓储时间的延长，五味子药材受温度、湿度及虫蛀的影响，药材质量会变差[6]，木脂素类成分含量会逐渐降低，因此应当避免使用放置时间过久的陈品，这也是医院、药房以及制药企业采购五味子时需要特别关注的问题。

五味子是辽宁省的道地药材，又称“辽五味”，含量测定结果也在一定程度上说明了这一点，29批样品中，总木脂素含量最高为13.98 mg/g，产自辽宁，且辽宁各批次木脂素含量整体均较高，优于吉林、黑龙江产区的五味子。此外从表4中可以看出，五味子醇甲虽然在5种木脂素类化合物中含量最高，但是另外几种木脂素类成分的含量也较高，比如五味子醇乙、五味子乙素，其中五味子乙素具有显著的生物活性，在临床上应用广泛[7-8]。这说明单纯以五味子醇甲的含量来评价五味子药材及制剂的质量有所欠缺，应该尝试以多种指标综合评价，本实验为评价五味子中的木脂素类成分提供了一种快速、可靠、科学的检测方法。

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[3]邱宏涛，赵筱萍，李正，等．基于网络药理学的五味子木脂素类主要药效作用研究[J]. 中国中药杂志，2015，40(3):522-527．

[4]陶小芳，宿树兰，江署，等．五味子药渣提取物中木脂素类成分分析及其对急性肝损伤模型大鼠的保护作用[J]. 中草药，2016，47(17):3051-3057．

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[6]拱健婷. 易变质中药加速试验方法研究与质量预测模型的建立[D].北京：北京中医药大学,2017．

[7]迟德彪. 五味子乙素对人神经胶质瘤血管内皮细胞生长因子表达的影响[D].广州：南方医科大学,2008．

[8]刘振. 五味子乙素抑制乳腺癌侵袭和转移的体内体外研究[D].杭州：浙江大学，2011．