激动性CD40抗体通过调节Th1/Th2平衡增强抗肿瘤作用的机制研究

最新研究显示，全球每年新发现约1 400万例肿瘤患者，我国肿瘤的发生率和死亡率也呈逐年升高趋势［1］。由于恶性肿瘤进展快、易复发的特点，使得传统的治疗手段如手术、放疗、化疗等具有一定的局限性，因此通过诱导机体的正向免疫促进对肿瘤细胞的免疫清除作用，已成为近年来肿瘤免疫治疗研究的热点。激动性CD40单链抗体（CD40ScFv）保留单克隆抗体具有活性的ScFv片段，去除全抗体的Fc片段，与激动性CD40单克隆抗体（CD40mAb）相比，其分子量小，易于到达病变部位，在机体代谢中也比较快，不良反应较小。本研究旨在观察激动性CD40单链抗体（CD40scFv）抑制小鼠肿瘤生长情况及对肿瘤组织中Th1和Th2平衡的改变，探讨其通过调节Th1/Th2平衡达到增强抗肿瘤作用的机制，为激动性CD40抗体进一步在临床应用上提供实验基础和理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象 Balb/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术公司，小鼠乳腺癌4T1细胞由天津医科大学第二医院分子影像实验室惠赠，带有CD40scFv基因片段的重组质粒由天津医科大学总医院普通外科研究所惠赠。实验获医院动物保护和应用委员会批准。

1.1.2 主要试剂及仪器 SDS-PAGE凝胶试剂盒（北京Solarbio公司），Ⅳ型胶原酶、Ⅰ型DNA酶（北京So⁃larbio公司），小鼠CD40单克隆抗体（美国R&D Sys⁃tems公司），台式离心机（美国Thermo Electron Corpo⁃ration公司），蛋白电泳仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 CD40ScFv诱导表达与SDS-PAGE检测 将重组质粒pET28a-CD40ScFv转化至大肠杆菌中，带有重组质粒的菌体在IPTG诱导前和诱导后分别离心收集菌体，使用超声波裂解后将上清和沉淀进行SDSPAGE检测。

1.2.2 CD40ScFv的Western blot与BCA蛋白定量检测 行SDS-PAGE电泳后取下凝胶，将PVDF膜、滤纸与凝胶于电转仪器上进行转膜。TBST洗脱PVDF膜，加入抗小鼠单克隆抗体过夜。取出洗脱后加入HRP标记抗小鼠IgG，按照ECL方法进行显色曝光。将纯化后的CD40ScFv蛋白通过BCA蛋白定量试剂盒进行定量检测，通过对比样品的吸光度值与标准曲线，估算样品中CD40ScFv蛋白的浓度。

1.2.3 小鼠乳腺癌4T1细胞复苏、培养与单细胞悬液的制备 取出小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速转移到37℃恒温水浴箱中，待其完全融化后离心，向离心管中滴加3 mL完全培养基，置于恒温培养箱。取出小鼠乳腺癌4T1细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态，加入1 mL胰酶-EDTA进行消化，将细胞吹打混匀，制成单细胞悬液。调整细胞浓度至2×108/mL。

1.2.4 Balb/C小鼠皮下成瘤与激动性CD40抗体治疗对Balb/C小鼠右腋下皮肤进行消毒，于消毒部位刺破皮肤并水平进针1 cm，注射单细胞悬液约200 μL。将单细胞悬液接种于15只正常小鼠右腋下，每隔3日观察并记录肿瘤大小的变化。于接种后第9天开始给予干预并分为以下3组：1）CD40ScFv组：给予上述从体外制备的CD40ScFv，治疗剂量为2 μg/g，治疗方式为瘤体注射；2）CD40mAb组：4 μg/g，瘤体注射；3）NS组：给予同体积的生理盐水。

1.2.5 ELISA法检测肿瘤组织IL-12的浓度 剥取皮下肿瘤，剪成1 mm3大小的组织块，秤取400 mg组织块放入组织匀浆器，加入PBS溶液3 mL，研磨制成单细胞悬液，离心并留取上清。将肿瘤组织上清充分混匀，与配置好的标准品加入到酶标孔板中。使用多功能酶标仪测定各孔450 nm处OD值，通过标准曲线及样品的吸光度值计算出肿瘤组织中的IL-12浓度。

1.2.6 肿瘤组织浸润淋巴细胞的分离 将剪碎的肿瘤组织块放入离心管中，加入RPMI 1640培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅰ型DNA酶，吹打混匀。将离心管中的悬液过滤并离心，吸取中间云雾层细胞，该细胞层即为淋巴细胞层。

1.2.7 流式细胞术检测肿瘤组织Th1和Th2 将淋巴细胞层离心后弃去上清，加入500 μL完全培养基，使细胞充分混匀。将细胞悬液加入到流式管中，各管分别加入FITC标记CD4流式抗体。各管离心并弃去上清，使用Fix and Perm重悬细胞并充分混匀，分别加入APC标记的IL-4流式抗体与PE标记的IFN-γ流式抗体，上机。

1.3 统计学方法

运用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD40ScFv的诱导表达

在25～35 kD诱导前、后的沉淀中有一个明显的条带，符合预计的CD40ScFv蛋白的大小（图1）。

2.2 Western blot检测CD40ScFv蛋白

进一步确定纯化后所得的产物为CD40ScFv目的蛋白，条带大小约为27 kD，与预计的蛋白大小一致（图2）。

2.3 BCA检测CD40ScFv蛋白

CD40ScFv蛋白浓度在562 nm处的吸光度值为0.5083，根据标准曲线计算出的蛋白样品浓度为1.122 mg/mL。

2.4 小鼠乳腺癌4T1细胞培养

小鼠乳腺癌4T1细胞在显微镜下观察生长状态良好，胎盘蓝染色细胞活力在95%以上（图3）。

图1 SDS-PAGE检测蛋白表达电泳图

图2 Western blot检测CD40ScFv蛋白表达

图3 显微镜下小鼠乳腺癌4T1细胞（台盼蓝染色×200）

2.5 激动性CD40抗体瘤体注射对肿瘤生长的影响

记录3组的肿瘤体积变化，绘制出小鼠肿瘤生长曲线（图4）。CD40ScFv组与CD40mAb组肿瘤大小均显著小于NS组，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明激动性CD40抗体可以显著抑制肿瘤的生长。

2.6 ELISA法检测肿瘤组织中IL-12浓度

CD40ScFv组肿瘤组织中的IL-12浓度为（396.27±48.13）pg/mL，CD40mAb组为（457.63±58.37）pg/mL，均显著高于NS组（79.51±14.97）pg/mL，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明激动性CD40抗体可以显著诱导肿瘤组织中的IL-12表达（表1）。

图4 小鼠肿瘤生长曲线

表1 CD40ScFv、CD40mAb与生理盐水对肿瘤组织中IL-12浓度的影响

2.7 流式细胞术检测小鼠肿瘤组织Th1和Th2比值

CD40ScFv组中的Th1/Th2细胞比值为6.32±0.87，CD40mAb组为5.54±0.71，均显著高于NS组1.79±0.38，差异具有统计学意义（P＜0.05，表2）。表明激动性CD40抗体可以改变肿瘤微环境中Th1/Th2细胞的失衡，发挥抗肿瘤的作用（图5）。

图5 CD40ScFv、CD40mAb与NS组肿瘤组织中Th1/Th2流式细胞图

表2 流式细胞术检测CD40ScFv、CD40mAb与生理盐水对肿瘤组织中的Th1/Th2比值影响

3 讨论

目前，用于免疫治疗的药物主要是单克隆抗体，其能够特异性结合免疫细胞表面抗原，激活机体内的免疫效应细胞，增强对肿瘤细胞的免疫杀伤作用［2］，具有特异性强、均一性好等优点。Hodi等［3］报道，细胞毒性T细胞相关抗原4的特异性单克隆抗体ipilimumab已在晚期黑色素瘤Ⅲ期临床试验中进行，接受治疗者与未接受治疗者比较具有总体生存优势。一些CD40单克隆抗体虽然已进入临床试验，并且取得了良好的效果，但因单克隆抗体的分子量大，不能很好透过血管间隙到达肿瘤组织，而且易引起不良反应，表现出一定的局限性［4］。CD40单链抗体（CD40ScFv）保留了单克隆抗体具有活性的功能区域，同时与单克隆抗体相比，其分子量小，易于到达病变部位，在机体代谢中也比较快，不良反应较小。本研究将构建好的原核表达载体转化到大肠杆菌中后进行诱导表达，获得需要的CD40ScFv蛋白。IPTG是一种稳定的蛋白表达诱导剂，从而使CD40ScFv大量表达。

树状突细胞（dentritic cell，DC）是目前已知功能最强的抗原提呈细胞，在诱导CD4+T淋巴细胞活化过程中起着重要的作用。根据所分泌的细胞因子的不同，CD4+T淋巴细胞可分为Th1型和Th2型，Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，主要调节细胞免疫反应，所分泌的细胞因子具有良好的抗肿瘤作用［5］。Th2细胞分泌IL-4、IL-10等细胞因子，所分泌的细胞因子具有抑制肿瘤免疫反应的作用。机体中的Th1与Th2细胞处于动态平衡，其平衡的改变与许多疾病有关，如肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应等，这种平衡的改变称为Th1/Th2漂移［6］。Th1/Th2平衡转向以Th2细胞占优势状态，导致Th1/Th2细胞比值下降，这种改变发生于大多数临床肿瘤患者，包括肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌、基底细胞癌等［7］。Tosol⁃ini等［8］报道结肠癌患者癌组织中的Th2细胞分泌的细胞因子显著升高，Murakami等［9］报道黑色素瘤患者Th2细胞占优势状态。本研究发现激动性CD40抗体能改变肿瘤组织中Th1/Th2细胞比值，其具体的机制尚不清楚。有研究报道，IL-12是影响Th细胞分化的重要细胞因子，肿瘤微环境中DC等抗原提呈细胞分泌的IL-12下降可能是影响Th细胞分化失衡的重要原因［10］。Shao等［11］报道，TIMP3可以在体外抑制DC活化与成熟，使其下调分泌IL-12等，进而使Th1/Th2比值下降。激动性CD40抗体能够代替CD40配体与DC表面的CD40结合，进而促进DC的活化与成熟，上调IL-12的分泌［12］。

综上所述，激动性CD40抗体通过促进DC活化成熟后分泌IL-12，可能是影响肿瘤微环境中Th1/Th2平衡的重要机制之一。

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