不同培养条件对紫萁原叶体发育的影响

邓 坦， 周 逊， 张 念

(1.遵义师范学院生物与农业科技学院，贵州遵义 563006； 2.贵州省赤水河流域植物资源保护与应用研究特色重点实验室，贵州遵义 563006)

紫萁(OsmundajaponicaThunb)属蕨类植物门真蕨类原始厚囊蕨纲紫萁目紫萁科紫萁属的一种多年生草本植物，既是一种山野菜又是一种名贵中药材[1]。其拳卷幼叶经过干制处理，称为薇菜，是出口日、韩的名贵山野菜。紫萁根茎入药，具有一定的应用价值，很多研究表明，薇菜含有钙(Ca)、铁(Fe)、锌(Zn)等元素和多种氨基酸，具有较高的营养成分[2-3]，但其自然繁殖能力弱，不利于种群的扩大和人工栽培。目前，中国产的薇菜均为采自山区的野生紫萁，质优，无污染。近年来，由于滥采，其野生资源日渐枯竭，产品供不应求，为合理开发这一珍稀资源，提高其品率，满足市场需求，进行人工规模栽培势在必行，而人工栽培的关键是解决紫萁成苗问题，对其孢子萌发条件的研究是解决其有性生殖问题的重要条件之一。

国内外对紫萁孢子的人工繁殖已有研究[1，4-11]，但对一些控制紫萁孢子萌发和原叶体发育的因素还有待更深入的研究。本试验就不同碳源浓度、不同激素水平、不同成熟度的紫萁孢子这几个因素对紫萁原叶体发育的影响进行探究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫萁孢子体材料于2013年4月中旬采自贵州遵义大板水国家级森林公园，所采集的试验材料由遵义师范学院生命科学学院植物资源实验室鉴定，并保存标本。采集不同成熟度的孢子叶穗，放入洁净的密封袋中，置于5 ℃冰箱中保存供使用。

1.2 不同培养基的配制

无机培养基采用MS、1/2MS、1/4MS(1/2MS、1/4MS培养基的大量元素含量分别为MS培养基全量的1/2、1/4，铁盐和有机物的含量与MS培养基相同)，pH值为6.0，培养基配制好后分装到培养瓶中，培养基于121 ℃高压灭菌120 min。

1.3 消毒方式

取适量不同成熟度的孢子体，先用适量洗衣粉洗10 min，洗去表面杂质，然后用自来水冲洗30 min，再然后用75%乙醇处理 1 min 后用无菌水清洗3～4次，再用0.1%氯化汞处理 8 min，最后用无菌水清洗3～4次后就可进行接种。

1.4 正交试验

本试验分3个组合：组合1以MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，附加不同浓度的蔗糖，pH值6.0，培养不同成熟度的外植体；组合2以MS、1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA和NAA，pH值6.0，培养不同成熟度的外植体；组合3以MS、1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA、2，4-D，pH值6.0，培养未完全成熟的外植体。

将各个处理置于光照时间12 h/d、光照度2 000 lx、温度25 ℃的条件下培养，定期观察其生长情况，3 d后观察孢子的萌发情况，定期记录孢子颜色的变化，25～30 d后分别对每个处理在显微镜下观察原叶体的形态结构，并统计每种处理条件下的孢子萌发率。

2 结果与分析

2.1 不同蔗糖和无机盐浓度对紫萁孢子萌发和原叶体发育的影响

由表1可以看出，不同蔗糖浓度和无机盐浓度能影响紫萁孢子的萌发和原叶体的发育。蔗糖浓度为2%的培养基比含量为3%的培养基更有利于孢子的萌发和原叶体的发育(图1-A)。1周后孢子开始萌发，表面开始分化出一些绿色小点，这与张敏等对紫萁的组织培养而得出的结论[5]相符合。在没有添加任何植物激素的条件下培养紫萁孢子，成熟度为3的紫萁孢子的萌发率为0，成熟度为1的紫萁孢子的萌发率最高，最高达 66.67%(表1)。

表1 不同蔗糖和无机盐浓度对紫萁孢子萌发和原叶体发育的影响

注：成熟度为1表示还未完全成熟的紫萁孢子，孢子还略显绿色；成熟度为2表示刚成熟的紫萁孢子；成熟度为3表示已成熟了一段时间的紫萁孢子。萌发时间为“-”表示未萌发。原叶体发育情况为“-”表示无原叶体出现，“+”表示出现原丝体，“++”表示出现片状体和幼原叶体，“+++”表示出现心形原叶体。下表同。

2.2 不同浓度无机盐、6-BA、NAA对紫萁孢子萌发和原叶体发育的影响

由表2可以看出，不同浓度无机盐、6-BA、NAA均影响紫萁原叶体的发育，无论什么样的浓度配比，成熟度为1的孢子体萌发率都要高于成熟度为2和3的萌发率，成熟度为3的孢子体在1/2MS、1.0 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA条件下有幼原叶体和片状体的发育。

在MS+0.1 mg/L 6-BA+成熟度1和1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+成熟度1条件下紫萁原叶体发育最好(图1-C)。在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度1和MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+成熟度1条件下还是片状体(图1-B)，在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度3的条件下处于2～6个细胞的丝状体(图1-A)，在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+成熟度1和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度1条件下的原叶体发育较好(图1-C)。

2.3 不同浓度无机盐、6-BA、2，4-D对紫萁孢子萌发和原叶体发育的影响

由表3可以看出，不同无机盐、6-BA、2，4-D浓度能影响紫萁原叶体的发育，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D都有利于紫萁原叶体的发育，0.5 mg/L为最佳浓度。在不同浓度外源激素条件下紫萁原叶体发育不同，在MS+0.1 mg/L 2，4-D(无6-BA)与MS+0.5 mg/L 2，4-D(无6-BA)和1/2MS+0.5 mg/L 2，4-D(无6-BA)的条件下，发育为心形原叶体的时间较快(图1-C)，在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D条件下为片状体(图1-B)。

3 讨论

在外植体的选择上，笔者所在课题组选取了3种不同成熟度的穗状孢子体：成熟度为1，孢子体颜色为青绿色；成熟度为2，孢子体刚由青色转黄色；成熟度为3，孢子体由黄色转褐色。无论是在何种条件的处理下，成熟度为1的孢子体萌发要好于成熟度为2、3的孢子体，究其原因，成熟度为1的孢子体未成熟，细胞还未分化完成，在适度培养条件的刺激下，更能激发细胞的全能性。

在无机盐浓度的选择上，笔者所在课题组选择了3种浓度，分别是1MS、1/2MS、1/4MS。由结果看出，在低浓度无机盐条件下，孢子萌发率较高，这在实际生产过程中对于控制成本是有益的。

在碳源浓度选择上，笔者所在课题组选择了2种浓度进行比较，分别是3%、2%蔗糖。由结果看出， 在2%的低碳源浓度下，孢子萌发较好，这在大规模的实际生产过程中，对于控制成本也是有益的。

表2 不同浓度无机盐、6-BA、NAA对紫萁孢子萌发和原叶体发育的影响

不同无机盐浓度、6-BA浓度、NAA浓度均影响紫萁原叶体的发育。由结果可以看出，无论什么样的浓度配比，成熟度为1的孢子体萌发率都要高于成熟度为2、3的，成熟度为3的孢子体在1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培养条件下有丝状体和片状体的发育。

不同浓度无机盐、6-BA和2，4-D的配比试验表明，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D都有利于紫萁原叶体的发育，0.5 mg/L 为2，4-D最佳浓度。

在控制条件下，碳源浓度为2%的培养基有利于孢子的萌发和原叶体的形成；随着无机盐浓度的降低，孢子萌发率上升，以1/4MS最佳；1 mg/L 6-BA更有利于紫萁原叶体的发育；NAA浓度为0.01 mg/L，原叶体长势较好；0.1～1 mg/L 2，4-D均有利于紫萁原叶体的发育，其中0.5 mg/L为最佳浓度；还未完全成熟的孢子体的萌发率较高，最高达50%以上。在2%蔗糖+1/4MS+1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D和孢子体未完全成熟的条件下，更有利于紫萁原叶体的发育。

表3 不同浓度无机盐、6-BA、2，4-D对紫萁孢子萌发和原叶体发育的影响

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