饰纹姬蛙的人工驯养与繁殖

2018-03-26王循刚王守红李玉龙张美华张梦洁刘露莎江建平

四川动物 2018年2期

王循刚，王守红，李玉龙，张美华，张梦洁，刘露莎，江建平

1. 中国科学院成都生物研究所，成都610041； 2. 中国科学院大学，北京100049；3.南京师范大学生命科学学院，南京210046)

饰纹姬蛙Microhylafissipes隶属于两栖纲Amphibia无尾目Anura姬蛙科Microhylidae姬蛙属Microhyla，分布于东亚及东南亚地区，国内主要分布于华东、华南、华北和西南部分地区，具有种群数量大、个体发育迅速、产卵量多、蝌蚪透明、一年多次产卵且繁殖期长、变态时间短、性成熟较快等特点(费梁等，2009)，在胚胎发育、适应性机制、人类疾病及环境健康等方面有重要价值(Liuetal.，2016)。

目前，有关饰纹姬蛙的研究涉及多方面，耿宝荣等(1996)、刘绍龙等(1996)、徐梦阳和徐剑(2012)以及Wang等(2017)对饰纹姬蛙的胚胎发育过程进行了相关研究；薛清清等(2005)、郭赛男等(2014)采用静态换水法研究了杀虫剂、除草剂及杀菌剂对饰纹姬蛙蝌蚪的急性毒性及联合毒性，并对其进行了安全性评价；韦力等(2013)、魏洁(2016)对饰纹姬蛙求偶鸣声特征和繁殖特征进行了研究；另外，还涉及生物地理学和群体遗传学(Zhangetal.，2013；Yuanetal.，2016)、基于转录组学的变态发育和肺发育过程中重要基因调控的研究(Zhaoetal.，2016；Liuetal.，2017)。这些研究不仅促进了饰纹姬蛙的模式化，也对饰纹姬蛙的人工饲养及人工繁育提出了要求。

本研究对饰纹姬蛙进行实验室饲养驯化，并对其进行人工繁育，分析实验室条件下饰纹姬蛙的繁

殖行为和产卵情况等，旨在完善人工繁殖和饲养技术，为研究工作提供适宜的研究材料，也可为无尾两栖动物的人工驯化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

188只饰纹姬蛙繁殖亲本于2015年7月—2017年5月分别采自四川省双流区(103.842 8°E，30.582 5°N)、四川省绵阳市(104.192 2°E，31.354 4°N)、四川省乐山市(103.782 7°E，29.453 5°N)和海南省万宁市(110.478 3°E，18.946 7°N)(表1)。在实验室将雌雄分开以每盒5只饲养在透明饲养盒A(长32 cm×宽22 cm×高15 cm；模拟自然环境：盒中布置苔藓、砂石，加少量水，并标注产地、采集时间等信息；图1：A)。每天定时投喂残翅果蝇Drosophilamelanogaster，后期挑选具有优良繁殖性状的雌雄个体进行人工催产。

表1 饰纹姬蛙样本采集情况Table 1 Sampling information of Microhyla fissipes

1.2 实验试剂与仪器

电子秤(0.001 g)、游标卡尺(0.01 mm)、一次性注射器(1 mL)、培养皿(直径12 cm)、塑料吸管(3 mL)、注射用促黄体素释放激素类似物A3(luteinizing hormone releasing hormone，LHRH-A3；宁波市三生药业有限公司)、螺旋藻粉(中盐制盐工程技术研究院)。

1.3 实验方法

1.3.1雌雄亲本的挑选挑选繁殖体征较好的雌雄亲本，雌性选择腹部较大且软，从腹部能明显看到成熟卵子的个体，其卵粒较大，动植物极明显(动物极黑褐色，植物极乳白色)；雄性选择能鸣叫，声囊大且颜色较黑，腹部靠近泄殖腔位置发红且有2条“V”形白线的个体。测量体质量和体长。

1.3.2人工催产将LHRH-A3用灭菌的0.65%生理盐水配成注射液(3 μg·mL-1)，对饰纹姬蛙进行腹腔注射(0.3 μg/g)。将注射后的饰纹姬蛙亲本按雌雄1∶1置于繁殖饲养盒B(长27 cm×宽17 cm×高15 cm；模拟自然环境：盒内用青苔、水草、砂石进行布置，水陆面积比为3∶2；图1：B)，每盒雌雄各1只，并标注编号。繁殖环境气温控制在28 ℃。注射LHRH-A3当晚人工观测繁殖行为，并记录求偶过程和交配时间。为了将人为干扰程度降到最低，使用仿月光夜间灯照明，且避免光照对动物饲养盒的直射。繁殖亲本完成抱对产卵后，结束观察。12 h左右后查看产卵情况，及时将受精卵从繁殖饲养盒B中取出并转入大的白色饲养盒C(长45 cm×宽32 cm×高11 cm；图1：C)中进行自然孵化。统计产卵总数、受精数、孵化数等，并再次称量产卵后雌雄亲本的体质量以计算繁殖投入。数据均以平均数±标准差表示。

图1 饲养盒 Fig. 1 Breeding containers

2 实验结果

2.1 繁殖行为

对挑选好的饰纹姬蛙雌雄亲本人工注射LHRH-A3催产，3 h后观察记录其繁殖行为，雄蛙会持续不间断鸣叫一段时间，同时面朝雌蛙展示声囊大小，求偶成功后抱对。产卵前，雌蛙会躁动不安，然后跃入水中；产卵时，雌蛙漂浮于水面，将头埋入水中，尾部上翘与雄蛙尾部贴近，抖动，从泄殖腔排出卵粒，反复多次；产卵完毕后，雄蛙和雌蛙分开。通过观察，发现抱对持续时间为7～12 h。

2.2 产卵情况

2.2.1产卵量与繁殖周期2015年7月—2017年5月，饰纹姬蛙共有98次成功人工催产产卵的记录，包括四川省双流区、四川省乐山市、四川省绵阳市、海南省万宁市4个不同地点的亲本。其中，2015年繁殖成功8次，2016年繁殖成功53次，2017年繁殖成功37次。窝卵数15～1 100枚，平均每只雌蛙单次产卵310枚±203枚(n=98)。其中，海南省万宁市一组亲本(编号：HN001P)于2016年8月13日采回，至2017年5月共成功繁殖产卵5次，产卵日期分别为2016年8月14日、2016年9月29日、2017年3月21日、2017年4月 6日和2017年5月5日。在2017年的繁殖实验中发现，饰纹姬蛙同一亲本2次繁殖时间间隔最小可缩短到16 d。

2.2.2雌雄亲本大小对产卵量的影响共获得76对成功产卵饰纹姬蛙亲本的产卵前体质量、体长测量值。雌蛙体质量1.30 g±0.36 g，体长22.6 mm±1.9 mm；雄蛙体质量1.05 g±0.24 g，体长21.8 mm±2.1 mm。分析结果发现，76对饰纹姬蛙平均成功产卵309枚±214枚，与雌蛙体质量显著正相关(R2=0.44，P<0.001，n=76；图2)，与雄蛙体质量、雌蛙体长及雄蛙体长均无相关关系。

2.2.3产卵量与雌雄亲本繁殖投入的相关性共获得32对繁殖亲本产卵前后体质量的测量值，雌蛙体质量减少量为0.24 g±0.17 g，与产卵量显著正相关(R2=0.47，P<0.001，n=32；图3)。表明雌蛙繁殖投入与体质量变化显著相关，但产卵量与雄蛙体质量变化无相关关系。

图3 饰纹姬蛙窝卵数与雌蛙繁殖投入的关系Fig.3 Relationship between female reproductive input and the clutch size of Microhyla fisspes

2.3 动物饲养

2.3.1蝌蚪的饲喂刚孵化的饰纹姬蛙蝌蚪靠体内的卵黄提供营养，待卵黄消失(蝌蚪发育至26期)(Wangetal.，2017)时以熟鸡蛋黄开口(少量多次投喂)。开口1、2 d后饲喂螺旋藻粉，每天早晚各投喂1次。为保证水体中溶解氧含量高于 6 mg·L-1，用充气泵24 h不间断充空气，并且每3 d换1次水。水温控制在26 ℃，光照周期12L∶12D。

2.3.2幼蛙的饲喂完成变态的幼蛙(发育至45期)一般1～2 d后即可喂食，饵料为棘跳虫Onychiuyusfimeitayiuslinnaeus和白符跳Folsomiacandida。按1只幼蛙10～15只的投喂量投喂。每天投喂1次，根据进食情况适当增加或者减少投喂量。随着幼蛙的生长发育，一个月后逐渐过渡到饲喂残翅果蝇。环境温度保持26 ℃，相对湿度保持70%，光照周期12L∶12D。

2.3.3成蛙的饲喂成蛙主要投喂残翅果蝇，每天投喂1次。按1只成蛙5～10只的投喂量投喂，并观察采食情况。根据成蛙体型进行合理密度的饲养调整。对于成功繁殖后代的雌雄亲本，在饲养盒A中继续饲养，并每隔15 d查看雌雄亲本的身体状况，以便后续人工繁殖。其他饲养环境条件与幼蛙一致。

3 讨论

结合野外采集饰纹姬蛙的情况和实验室饲养情况，推测其繁殖期为3—10月，其中5—8月为高峰期。人工繁殖实验发现，同一对饰纹姬蛙亲本在 9个月内成功繁殖并产卵5次(平均产卵量为133枚±64枚)，且繁殖间隔可以缩短到16 d。蔡明章等(1991)曾发现一只雌性饰纹姬蛙一年可以产卵6次。因此，饰纹姬蛙具有繁殖期长、繁殖间隔短、多次产卵等优点，为其模式化提供了基础条件。同时也说明，本实验室的饲养条件可以满足饰纹姬蛙的生长和繁殖需求。

早期蛙类的人工繁殖(蔡明章，1980；陈世濂，张艳璇，1994)是将雄蛙处死以取其睾丸进行人工受精，无法观察其繁殖行为，因此后来选用LHRH-A3、绒毛膜促性腺激素(HCG)等激素类针剂对两栖动物进行人工催产(潘炯华，梁淡茹，1990；刘韬等，2009；唐秀锋等，2016)。在实验过程中发现，对饰纹姬蛙注射LHRH-A3的效果好于HCG。这对今后实验室无尾两栖动物的人工繁殖提供了一定的参考。

此外，雌蛙产卵量与亲本体质量、体长相关性比较结果表明，在整个繁殖过程中，雌蛙的身体指标至关重要，这与其他多数研究结果一致(Kozlowska，1971；Gibbons & Mccarthy，1986；李斌，卢欣，2004)。同时，雌蛙的繁殖投入与产卵量也呈显著正相关关系，即雌蛙经历一次繁殖，产卵量越多，体质量减少越多。因此，在进行蛙类人工繁殖时，应该选择体型较大、繁殖性状较好的雌性个体进行催产，以便获取更多更好的实验材料；为了后续多次优质产卵，促进体况尽早恢复至关重要。

本研究中，在蝌蚪早期饵料选择时，首先用鱼饵料和蛋黄一天2次交替饲喂，但无论是蛋黄还是饲料都很容易破坏水质，需要勤换水，不仅给蝌蚪造成不良应激反应，同时加大工作量。后期又尝试饲喂丰年虾，效果有了一定改善。通过不断地实验探索，发现以螺旋藻粉饲喂饰纹姬蛙蝌蚪效果最好，更符合其自然取食的种类和环境。螺旋藻粉既不容易坏水，蝌蚪也比较喜食，生长状况较好。变态后幼蛙和成蛙的饲养相对蝌蚪容易，模拟野外取食习性，幼蛙投喂跳虫，亚成体及成蛙投喂残翅果蝇。经过近2年的饲养驯化，不论是蝌蚪、幼蛙还是成蛙，都已经对固定的饵料投喂有了很好的适应性，并且建立了饵料饲养体系，即“熟蛋黄-螺旋藻粉(饲喂蝌蚪)-跳虫(饲喂刚变态的幼蛙)-残翅果蝇(饲喂亚成体和成体蛙)”，为成功进行实验室人工驯养繁殖饰纹姬蛙提供了基础保障。

致谢：杨登为、曾一唯、常利明同学在饰纹姬蛙野外采集过程中给予了帮助，王燕老师在动物饲养方面提供了指导和帮助，谨此一并衷心感谢。

蔡明章，郭刚，杨明筑，等. 1991. 饰纹姬蛙Microhylaornata(DumeriletBibron)生殖频次初探[J]. 福建师范大学学报(自然科学版)， 7(3)： 87-89.

蔡明章. 1980. 蛙类催产和人工授精方法[J]. 动物学杂志， 15(2)： 51-52.

陈世濂，张艳璇. 1994. 几种激素对棘胸蛙人工催产作用研究[J]. 福建省农科院学报， 9(1)： 47-50.

费梁，胡淑琴，叶昌媛，等. 2009. 中国动物志两栖纲(中卷)[M]. 北京：科学出版社： 904-910.

耿宝荣，温青，张秋金. 1996. 饰纹姬蛙的早期胚胎发育[J]. 动物学杂志， 31(5)： 17-21.

郭赛男，童美玲，陈文君，等. 2014. 烯唑醇·苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐对饰纹姬蛙蝌蚪的急性和联合毒性[J]. 安徽农业科学， 42(27)： 9350-9353.

李斌，卢欣. 2004. 中国林蛙繁殖产量与雌体大小及年龄的关系[J]. 武汉大学学报(理学版)， 50(4)： 493-496.

刘绍龙，宋志明，张家藻，等. 1996. 饰纹姬蛙早期胚胎发育的研究[J]. 四川大学学报(自然科学版)， 33(3)： 323-329.

刘韬，庄志鸿，杨声强. 2009. 基于生物技术调控棘胸蛙繁殖与养殖的研究[J]. 中国农学通报， 25(7)： 26-29.

潘炯华，梁淡茹. 1990. 虎纹蛙的人工繁殖初报[J]. 四川动物， 9(2)： 34-35.

唐秀锋，刘本祥，杨家贵，等. 2016. 大鲵室内培育及人工繁殖技术研究[J]. 南方农业， 10(16)： 67-69.