壳聚糖纳米颗粒包裹猪白细胞介素2和融合白细胞介素4/6基因对猪圆环病毒2型疫苗免疫的强化

陈祎， 宋婷玉， 李金海， 肖永乐， 曾光志， 万小平，杨璐一， 方鹏飞*， 王泽洲， 高荣*

1. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疾病防控和食品安全四川省重点实验室，成都610065；2. 四川省华派生物制药有限公司，成都610026； 3. 四川省动物疫病预防控制中心，成都610035)

细胞因子因其安全性和高效性而成为一种理想的免疫佐剂，例如γ-干扰素(IFN-γ)(Wangetal.，2013)、白细胞介素2(IL-2)(Yangetal.，2010)、白细胞介素4(IL-4)(Zhangetal.，2007)和白细胞介素6(IL-6)(Lietal.，2011)。IL-2、IL-4和IL-6在细胞和体液免疫反应中起重要作用。IL-2具有多种生物学功能，包括促进T细胞增殖和增强NK细胞的细胞毒性，刺激活化的B淋巴细胞增殖，并诱导免疫球蛋白分泌等(Collins & Oldham，1993)。IL-4可影响体液免疫和细胞免疫应答，如免疫球蛋白的产生、类别转换和分泌(Pasquinietal.，1997)。IL-6具有促进白细胞介素基因表达、B细胞分化、T细胞活化的作用(Kishimoto，2010)。

猪IL-2或IL-6与CpG免疫刺激序列的混合基因能有效提高动物对病原菌的抵抗力(Yangetal.，2010；Huangetal.，2013)；此外，猪IL-4/6融合基因与单独的IL-4和IL-6相比，能诱导机体产生更强的免疫应答；猪IL-4/6融合基因能加强大肠杆菌疫苗、猪肺炎支原体疫苗、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗对机体的体液和细胞免疫，提高接种动物的免疫保护性(Zhangetal.，2007；Zhangetal.，2012；Yangetal.，2013)；猪IL-2、IL-4、IL-6的融合基因(IL-4/6-2)相比于IL-4/6和IL-2在小鼠Musmusculus上可产生更强的免疫协同调节作用(杨璐一等，2014)。

因此，本实验在前期研究的基础上，为研制新型高性价比的PCV-2疫苗免疫调节剂，评估共表达IL-2和IL-4/6融合基因纳米颗粒对仔猪生长和PCV-2免疫应答的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒：真核表达载体VR1020-猪融合白细胞介素4/6-2(VRIL-4/6-2)，由本实验室构建并保存；壳聚糖(CS)：15 kD，脱乙酰度95%以上，购自Sigma Aldrich；多聚磷酸钠(TPP)：购自Sigma(USA)；鲎试剂：购自湛江A & C公司；疫苗：PCV-2灭活疫苗(ZJ/C株)(圆环康)和实验动物：健康21日龄长白、约克夏和杜洛克杂交仔猪均由四川省华派生物制药有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1VRIL-4/6-2真核表达质粒的大量制备及内毒素检测参照《分子克隆指南 第三版》(Josephetal.，2002)制备质粒，溶解于TE缓冲液，质粒浓度和纯度使用紫外分光光度计检测；质粒内毒素含量用鲎试剂检测。

1.2.2VRIL-4/6-2质粒壳聚糖纳米颗粒的制备离子交联法(Bodmeieretal.，1989)制备VRIL-4/6-2质粒壳聚糖纳米颗粒。将壳聚糖溶解于1%的冰醋酸溶液(pH5.5)，配制为2.4 mg·mL-1的溶液；ddH2O配制10 mg·mL-1的磷酸三苯酯(TPP)溶液；以上溶液均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。将VRIL-4/6-2质粒与适量TPP溶液混匀，55 ℃孵育20 min；壳聚糖与质粒质量比为30∶1，在50～55 ℃水浴磁力搅拌下将质粒与TPP的预混液缓慢滴加至壳聚糖溶液中，混合均匀，恒温孵育10 min备用，记作VRIL-4/6-2-CS。用Zetasizer3000HS/IHPL粒度仪检测纳米颗粒粒径和电位。

1.2.3动物实验10头21日龄长白、约克夏和杜洛克杂交仔猪，经ELISA和荧光定量PCR(qPCR)检测PCV-2、PRRS病毒、猪瘟病毒和支原体均为阴性。随机分成实验组和对照组，每组5头。实验组颈部肌肉注射2.5 mL VRIL-4/6-2-CS(0.5 mg·mL-1)，对照组注射相同剂量生理盐水；2组均颈部肌肉注射2.5 mL PCV-2疫苗。猪免疫接种前记为第0天，接种后第7、14、28天定时采集前腔静脉血用于检测免疫反应。接种前及实验结束第28天时分别测量2组仔猪的体质量，用于评价实验质粒对仔猪生长的影响。

观察组48例中，痊愈15例，显效20例，有效10例，无效3例，总有效率为93.75%；对照组48例中，痊愈11例，显效15例，有效12例，无效10例，总有效率为79.16%，观察组明显优于对照组，两组效果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

1.2.4PCV-2特异性抗体的测定取500 μL抗凝血低速离心后收集血清，参照ELISA试剂盒说明书操作，在酶标仪上测定OD630值，检测血清中PCV-Ab的含量，试剂盒购自武汉科前生物公司。

1.2.5IgG1和IgG2a的测定取500 μL抗凝血低速离心后收集血清，参照ELISA 试剂盒说明书操作，在酶标仪上测定OD450值，检测血清中IgG1和IgG2a的含量，试剂盒购自成都敏鑫科生物科技公司。

1.2.6CD4+和CD8+T淋巴细胞的测定取100 μL新鲜抗凝血摇匀，加入2 μL anti-porcine CD3-SPRD、2 μL anti-porcine CD4-FITC、2 μL anti-porcine CD8-PE，震荡混匀避光孵育30 min；加入600 μL红细胞裂解液，避光裂解10 min，500 r·min-1离心5 min，去上清；加入1 mL 磷酸缓冲盐溶液(PBS)，轻轻悬浮细胞，500 r·min-1离心5 min，去上清；重复洗涤1次，细胞沉淀加入300 μL PBS混匀，悬浮细胞，上机检测。

1.2.7荧光定量检测基因表达水平100 μL抗凝血加入1 mL的RNAiso pius，充分裂解后提取细胞总RNA，用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for Qpcr (One-Step gDNA Removal)反转录试剂盒合成cDNA。根据GenBank中的猪PPIA、TLR-2、TLR-7、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、STAT-1、STAT-2、STAT-3基因的cDNA序列，分别设计合成其特异性扩增引物(表1)。

以仔猪不同时期血液cDNA为模板，表1中设计的引物进行扩增。用Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪检测不同基因相对表达的情况，15 μL体系，用SsoAdvanceTMUniversal SYBR Green Supermix进行荧光定量分析。扩增参数为：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性 5 s，最佳退火温度退火30 s，40个循环。熔解曲线参数：65～95 ℃，每6 s上升0.5 ℃。PPIA为内参基因，采用2-ΔΔCT法分析实时荧光PCR数据，比较同一目的基因不同时期的相对表达水平差异。

1.2.8数据分析以上各数据用GraphPad Prism 6中的双因素方差分析和单因素方差分析进行差异比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

表1 荧光定量PCR特异性引物Table 1 The primers for qPCR

2 结果

2.1 仔猪体质量变化

实验开始及结束时分别称量每只仔猪的体质量，分别计算每组仔猪体质量的平均值和方差，仔猪体质量变化见表2。结果显示，实验组仔猪体质量增加显著高于对照组(P<0.05)。

表2 实验28天仔猪体质量变化Table 2 Body mass change of piglets during 28 days

注 Note：*P<0.05

2.2 仔猪血清中特异性抗体含量

在接种第7天后，实验组和对照组中均可以检测到PCV-2抗体，但是2组含量之间的差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

图1 仔猪血清中PCV-2抗体含量的变化Fig. 1 PCV-2 antibody titers in the serum of the experimental piglets

S/P=(S-N)/(P-N)=(样品OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)， 当S/P≥0.16时， 认为PCV-2抗体检测为阳性

S/P=(S-N)/(P-N)=(ODsample-ODnegative control)/(ODpositive control-ODnegative control)， titer of PCV-2 antibody was considered positive whenS/P≥0.16

2.3 仔猪血清中IgG1 和IgG2a 含量

实验组仔猪血清中IgG1的含量显著低于对照组(P<0.05)，而IgG2a的含量显著高于对照组(P<0.05)(图2)。

2.4 CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群

流式细胞术检测仔猪血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的数量变化，实验组仔猪血液中的CD4+T和CD8+T淋巴细胞的数量与对照组相比均显著增加(P<0.05)(图3)。

2.5 免疫相关基因表达量分析

2.5.1Toll-like受体基因表达定量分析实验组TLR-2基因的表达水平只在免疫后第14天显著高于对照组(P<0.05)，而实验组TLR-7基因的表达水平在免疫后第28天显著高于对照组(P<0.05)(图4)。

图2 仔猪血清中IgG1和IgG2a含量的变化Fig. 2 The change of the levels of IgG1 and IgG2a in the serum of piglets

图3 仔猪血液中 CD4+和CD8+T淋巴细胞数量的变化Fig. 3 CD4+ and CD8+ T cell numbers in the blood of experimental piglets

2.5.2细胞因子基因表达定量分析实验组仔猪血液中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α基因的表达水平在免疫后第28天均显著高于对照组(P<0.05)，其中，IL-4和IL-6基因表达水平分别在第7天和第14天显著高于对照组(P<0.05)(图5)。

2.5.3免疫信号传导分子基因表达定量分析STAT-1基因表达水平在免疫后第7～14天均显著高于对照组(P<0.05)，STAT-2基因表达水平在免疫后第14～28天显著高于对照组(P<0.05)，STAT-3基因表达水平在免疫后第7、28天显著高于对照组(P<0.05)(图6)。

3 讨论

细胞因子是调节动物免疫功能的关键分子。许多细胞因子被证实作为佐剂对体液或细胞免疫有增强作用(Pasquinietal.，1997；Kayamuroetal.，2010)。IL-2不仅支持T细胞和NK细胞的活化和增殖，还可以刺激和活化B淋巴细胞增殖和诱导免疫球蛋白分泌(Smith，1988；Collins & Oldham，1993)。IL-4可促进体液免疫，增加特异性和非特异性杀伤功能(Erbetal.，1997；Paul，2015)。IL-6可调节B细胞活化、抗体产生和Th1型免疫反应(Paul & Seder，1994；Kishimoto，2006)。有研究表明，猪IL-4/6、IL-2和IL-4/6-2融合基因均可安全增强动物系统和全面的免疫(Yangetal.，2010，2013；杨璐一等，2014)。基于以前的研究，本研究第一次将猪IL-4/6-2融合基因应用到猪上，来加强对PCV-2疫苗的免疫效果。

图4 仔猪TLR基因表达水平的变化Fig. 4 The change of expression levels of TLR gene in the blood of experimental piglets

图5 仔猪细胞因子基因表达水平的变化Fig. 5 The change of cytokine gene expression in the blood of experimental piglets

图6 仔猪免疫信号传导分子基因表达水平的变化Fig. 6 The change of the immune signal transduction molecules related genes in the blood of experimental piglets

本实验用壳聚糖将重组质粒VRIL-4/6-2包裹，制备壳聚糖纳米颗粒，与PCV-2疫苗同时对实验仔猪进行肌肉注射免疫接种。实验所用重组质粒通过2A短肽连接3种白细胞介素基因，构建共表达质粒。2A短肽具有的自剪切机制使连接前后的基因表达量相同(de Felipe & Ryan，2004；Szymczak & Vignali，2005)。裸露的基因不稳定且半衰期短，转染效率低；而壳聚糖包裹质粒可形成小的带正电荷的纳米颗粒，与裸露的质粒相比，它可以更有效地携带目的基因进入细胞，还可以抑制其在生物体内降解，被证实是一种有潜力的缓释材料，并且还具有生物相容性(Chewetal.，2003；Cui & Mumper，2003)，因此，壳聚糖作为基因载体的研究发展迅速(Buschmannetal.，2013；Fernándezetal.，2016)。Huang等(2005)通过荧光标记研究壳聚糖-DNA复合粒子进入细胞的过程，证实了壳聚糖-DNA复合粒子可以被细胞内吞，继而进行后续基因转染。之前的研究也表明，壳聚糖纳米粒子在动物身上用于基因传递几乎没有毒性和影响(Yangetal.，2010；Zhangetal.，2012)，并且空白载体质粒组与空白组没有差异(Yangetal.，2010)。本次实验由于阴性动物难于筛选获得，数量有限，并未进行空白载体质粒组的实验。

在实验期间，实验组和对照组仔猪注射局部均未出现病变、损伤或其他系统性症状。实验开始和结束时分别记录了每只仔猪的体质量，结果显示，实验组仔猪的生长速率显著高于对照组。有研究显示，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子可在猪小肠中持续表达，并且细胞因子除了直接的免疫调节作用，还可影响上皮细胞的生长、内环境稳态和免疫细胞的运输(Oswald，2006；Devriendtetal.，2010)。推测VRIL-4/6-2质粒对调节仔猪内分泌、促进物质代谢有积极作用。

PCV-2特异性抗体和PCV-2中和抗体是体液免疫反应的重要检测指标(Meertsetal.，2006；Fortetal.，2007)。研究结果表明，实验组和对照组仔猪血清中PCV-2抗体的含量差异无统计学意义，且实验组仔猪血清中IgG1的含量显著低于对照组，这表明IL-4/6-2可能没有明显增强仔猪对PCV-2疫苗的体液免疫。此外，有研究显示，诱导细胞免疫对于PCV-2的防控很有必要(Fortetal.，2009)。本研究结果表明，实验组的CD4+和CD8+T淋巴细胞数量显著高于对照组，并且实验组的IL-2、TNF-α基因表达水平在第28天显著高于对照组。IL-2、IFN-γ和TNF-α均由Th1细胞产生，Th1细胞可诱导巨噬细胞活化、迟发性超敏反应和IgG2a的产生(Mosmann & Coffman，1989；Abbasetal.，1996)。同时，本次实验发现，接种质粒的实验组比对照组产生了更多的IgG2a抗体，表明实验组仔猪产生了更强的Th1型免疫应答，相比对照组，VRIL-4/6-2-CS提高了仔猪对PCV-2疫苗的细胞免疫应答。

另外，实验组仔猪血液中IL-4、IL-6、TLR-2、TLR-7、STAT-1、STAT-2、STAT-3基因的表达水平在不同时间段内也显著高于对照组。TLRs是先天免疫系统的重要组成部分，Toll-like受体在先天免疫中识别不同病原菌的保守分子模式，并参与对病原体的特异性体液和细胞免疫反应的激活(Kawai & Akira，2010)。STAT-1、STAT-2参与IFNs应答反应，并在干扰素抗病毒应答调节中起重要作用(Mitchell & John，2005；Steen & Gamero，2013)；STAT-3可由多种细胞因子激活，例如IL-6、IL-12具有有效的抗炎作用，可调节细胞生长、凋亡、炎性基因的转录等重要细胞过程(Egwuagu，2009)；JAK激酶和STAT蛋白参与了许多细胞因子的信号转导，它在细胞因子介导的免疫反应和调控中具有重要作用(Shuai & Liu，2003)。综上，这些基因表达水平的提高表明VRIL-4/6-2-CS诱导了更加全面的免疫应答，增强了仔猪的先天性和适应性免疫应答。

总之，本研究结果首次证实VRIL-4/6-2-CS可有效协同增强仔猪对PCV-2疫苗的免疫应答。VRIL-4/6-2-CS是一种新型高性价比佐剂，可提高猪对抗PCV-2感染的免疫预防能力，具有重要应用前景。

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