IL-35抑制Th17细胞治疗柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎

张月婷，关玲霞，董平栓

病毒性心肌炎是指病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变，是猝死的常见病因之一，柯萨奇病毒被认为是其最重要的病原体[1]。虽然目前对病毒性心肌炎发病的具体分子机制还尚不清楚，但多项国内外研究证实[2-4]，机体因外源病原体入侵而过度激活的免疫反应在病毒性心肌炎发病过程中发挥着重要的作用。

白介素35（IL-35）是由一种新发现的Treg细胞合成分泌的，属于IL-12家族，并具有免疫抑制功能的细胞因子。IL-35能够促进CD4+CD25+细胞增长，抑制CD4+CD25-细胞增殖，同时也能够抑制由CD4+CD25-细胞分化的Th17细胞的增殖，进而减轻关节炎和炎症性肠病模型病情[5,6]。同时，Liu等[7]研究证实，IL-35可显著抑制Th1和Th17细胞增殖，进而减缓结肠炎疾病进展。由此可以看出，IL-35具有的免疫抑制功能在炎性疾病和自身免疫性疾病中具有潜在应用价值。

本文通过柯萨奇病毒B3（CVB3）感染小鼠建立CVB3诱导的病毒性心肌炎模型，腹腔注射聚醚酰亚胺（PEI）包装的IL-35表达质粒，以研究IL-35在病毒性心肌炎心脏组织的表达情况，并探讨其对病毒性心肌炎的治疗意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与病毒 选取6～8周龄BALB/c雄性小鼠共计60只（购买于中科院上海实验中心，中国），适应性喂养1周后用于实验；柯萨奇病毒通过HeLa细胞维持（购买于ATCC，美国），TCID50法测定病毒滴度。

1.2 实验动物处理 实验小鼠适应性喂养1周后，随机分为4组（每组各15只），于实验第1 d（d0）向感染组（IF组）、IL-35治疗组（IL-35组）和空质粒治疗组（p-FC组）腹腔注射103 TCID50 CVB3病毒。IL-35治疗组：于CVB3感染前1 d（d-1）、感染第1 d（d1）和第3 d（d3）IL-35组小鼠腹腔注射由0.258 ng PEI（Sigma，美国）包装的50 ug p-IL-35-FC质粒（由本实验室自行构建，重悬于0.2 ml PBS中）。空质粒治疗组：p-FC组腹腔注射空载FC质粒。正常组（Normal组）小鼠在d-1、d0、d1和d3均腹腔注射等量生理盐水。

1.3 酶联免疫吸附法检测IL-35 各组分别于实验第1、3、5和7 d各处死2只小鼠，分离心脏组织将新鲜分离的小鼠心脏组织样本放到盛有液氮的研钵中，研磨成细粉，然后加入0.5 ml RIPA裂解液（碧云天生物，中国）（加1%PSMF）进行匀浆，然后，在4℃下10 000 rpm离心10 min后（eppendorf，德国）收集上清。通过小鼠IL-35 Elisa检测试剂盒（南京森贝伽生物，中国）检测心脏组织IL-35表达水平。

1.4 实验动物心肌炎评分 各组分别于实验第1、3、5和7 d各处死2只小鼠，用生理盐水将小鼠心脏清洗干净后，用10%福尔马林溶液固定24 h以上，经脱水、透明、浸蜡、包埋和切片后进行HE染色，显微镜下观察小鼠心脏组织，根据心脏组织病变程度进行心肌炎评分：以无炎症病灶为0分；1-5个单核炎症病灶，且病变面积＜5%为1分；单核心性炎症病灶＞5个，或病变面积介于5%～20%为2分；弥漫性单核炎症病变面积＞20%且无坏死性病变为3分；出现坏死弥漫性炎症为4分。

1.5 流式细胞技术检测Th17细胞 实验第7 d结束处死各组小鼠，开腹取出脾脏，用200目过滤网挤压过滤，然后用加10%胎牛血清（Hyclone，美国）1640培养基（Hyclone，美国），向脾细胞重悬液中加入ACK裂解缓冲液液（Gbico，美国）37℃孵育3 min，然后1000 rpm离心10 min收集细胞，再加入1640培养基（+10%胎牛血清）重悬细胞，制成1.0×106个/ml脾细胞重悬液；然后向脾细胞重悬液中加入50 ng/ml佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（Sigma，美国），1 ug/ml离子霉素（Sigma，美国）以及10 ug/ml布雷非德菌素A（Sigma，美国），37℃+5%CO2孵育4 h。

用PE-anti-mouse-CD14单克隆抗体（Abcam，英国）标记小鼠脾细胞表面标志物，抗小鼠IL-17A单克隆抗体（Abcam，英国）作为二抗，通过MACSQuant® Analyzer 10流式细胞仪（Miltenyi Biotec，德国）检测Th17细胞数目。

1.6 统计学分析方法 研究数据通过SPSS 20.0软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差，组间比较采用t检验，Pearson法分析两指标间的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CVB3感染后各组小鼠体重和心肌炎评分 正常小鼠在饲养1、3、5和7 d体重逐渐上升，感染CVB3病毒1、3、5和7 d后，BALB/c小鼠体重下降分别为（22.3±4.2）g、（18.3±2.6）g、（17.1±2.4）g和（13.2±1.8）g，心肌炎评分逐步升高分别为0.5、1.5、3.0和4.0分，p-FC组小鼠在感染1 d后体重有所上升，但随后体重一直下降；IL-35组小鼠在感染CVB3病毒后体重均呈上升趋势；感染CVB3病毒1、3、5和7 d后，在同一时间点IF组小鼠体重与p-FC体重对比，差异无统计学意义（P＞0.05），但均低于IL-35组小鼠（P＜0.05），见表1。而在感染CVB3病毒后，BALB/c小鼠心肌炎评分均呈上升趋势，见图1。

2.2 心脏IL-35表达与病毒性心肌炎小鼠疾病严重程度呈负相关 酶联免疫吸附法检测各组小鼠心脏组织IL-35表达量，并通过Pearson法分析IL-35表达与体重减轻重量、心肌炎评分的相关性，结果显示：心脏IL-35表达水平与小鼠体重减轻重量（r=-0.532，P=0.034）和心肌炎评分（r=-0.670，P=0.005），呈负相关，见图2～3。

表1 CVB3感染后各组小鼠体重变化（g）

图1 CVB3感染后各组小鼠心肌炎评分变化

2.3 CVB3感染后各组小鼠脾脏Th17细胞比例CVB3感染小鼠7 d结束后，处死各组小鼠，通过流式细胞仪检测各组小鼠脾脏Th17细胞比例，结果显示：正常小鼠、IF组小鼠、IL-35组小鼠和p-FC组小鼠Th17细胞比例分别为（0.40±0.10）%、（1.30±0.20）%、（0.53±0.15）%和（1.33±0.21）%，见图4。

图2 心脏IL-35表达与CVB3感染小鼠后体重变化的关系

图3 心脏IL-35表达与CVB3感染小鼠心肌炎评分的关系

图4 IL-35过表达降低CVB3诱导心肌炎模型Th17细胞数量

3 讨论

病毒性心肌炎是一种肠道病毒或腺病毒感染引起的心脏组织炎症，病毒感染和过激的宿主免疫反应是引起病患死亡的两个最主要原因。在CVB3感染早期，其可能通过破坏心肌营养不良蛋白-肌内聚糖或者通过切割真核起始因子4而引起心肌细胞功能障碍[8]。在CVB3感染后期，促炎细胞因子和趋化因子会大量表达而引起过激炎症反应，并加重心脏损伤[9]。本文研究发现，小鼠在感染CVB3后体重呈现下降趋势，但心脏组织炎症病灶（心肌炎评分）却呈现增多趋势，而腹腔注射IL-35表达质粒可有效缓解这一现象，这提示我们抑制小鼠体内炎症反应可能是对病毒性心肌炎小鼠病情具有一定的缓解效果。

IL-35是一种由p53和EBI3亚基构成的细胞因子。虽然IL-35在功能和结构上属于IL-12细胞因子家族，但与现有IL-12、IL-23和IL-27这三种IL-12家族细胞因子来源于巨噬细胞、单核细胞或者树突状细胞不同，IL-35却有Treg细胞合成和分泌[10,11]。同时，研究还表明[5,6,12]，IL-35的主要功能包括抑制Teff细胞增殖、Th17细胞发展以及促进CD4+CD25-细胞的增殖，在炎症性疾病和自身免疫性疾病中具有潜在的治疗前景。本文研究发现，CVB3感染小鼠后IL-35在心脏组织的表达水平与小鼠心肌炎疾病严重程度呈负相关，进一步提示IL-35对CVB3诱导的病毒性心肌炎具有潜在的治疗价值。

同时，本文研究还发现，IL-35治疗可以显著降低小鼠脾脏因CVB3感染而增加的Th17细胞。Th17细胞是近年发现的除Th1和Th2细胞外的第三种CD4+T细胞亚群，因其可以分泌IL-17而得名[13]。体内研究证实，Th17细胞可以被IL-23刺激而分泌IL-17，进而构成IL-23/IL-17促炎反应轴，因而Th17细胞具有强大的促炎作用，其细胞数量增高是机体高炎症反应的主要表征之一[14]。Th17细胞作为炎症反应的重要效应细胞，已被证实参与病毒性心肌炎发病机制，降低Th17细胞数量可以帮助缓解病毒性心肌炎病情[15]。

综上所述，在心脏组织表达的IL-35可能通过抑制脾脏Th17细胞治疗柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎。

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