不同浓度葡萄糖对大鼠骨髓来源内皮祖细胞增殖、迁移及血管形成的影响

李中轩，陈韵岱

糖尿病是一种复杂的代谢综合征，特点是血糖升高伴随胰岛功能降低。糖尿病高血糖会导致血管相关并发症，包括视网膜病变、脑血管病变、心血管病变[1]。其中心血管病变最为严重，糖尿病产生多种有害代谢产物，如晚期糖化终末产物（AGEs）[2]，会损伤完整的血管内皮，并诱发炎症级联反应，经过一系列病理生理过程最终导致动脉粥样硬化斑块形成。若不稳定斑块发生破裂出血，将导致心肌梗死和心源性死亡。与正常人群相比，糖尿病患者伴随胰岛功能受损，加速胆固醇在巨噬细胞中聚集，形成泡沫细胞[3]，加速冠心病进展。同时糖尿病患者损伤的内皮会释放多种炎症因子，加重氧化应激以及炎症反应，并导致严重心血管事件发生[4]。

修复损伤血管内皮成为治疗糖尿病相关心血管病变的重要靶点。内皮祖细胞（EPCs）为内皮细胞的前体细胞，在修复损伤、维持管腔完整性等方面具有重要作用。研究发现EPCs不仅参与血管形成，同时也参与出生后血管生成和内皮损伤后的修复[5,6]。高糖环境会损伤EPCs，导致其功能障碍。本研究探究了不同浓度葡萄糖对EPCs增殖、迁移及血管形成能力的影响，为后续在高糖环境下研究EPCs病理生理机制提供合适的模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 SPF级SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。EGM-2培养基（Lonza），histopaque-1083（Sigma-Aldrich），Fibronectin（R&D），胎牛血清（Gibco），DilacLDL（Thermo Fisher Scientific），FITC-UEA-I（Sigma-Aldrich），结晶紫（Beyotime），基质胶（Corning），Cell counting kit-8（Dojindo Molecular Technologies），24-well Transwell chamber（Corning），酶标仪（BioTek），荧光倒置显微镜（Nikon），激光共聚焦扫描显微镜（Leica Microsystems）。

1.2 EPCs的分离与培养 将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，颈椎脱臼法处死。然后将处死大鼠放入预先准备好的75%酒精中消毒30 min。分离出大鼠后肢长骨，将表面神经、肌肉、筋膜尽量去除，暴露出两侧干骺端。用吸取EGM-2培养基的注射器至干骺端刺入后反复冲洗，直至骨髓腔内容物被完全吹出，长骨变白。反复吹打分离得到的骨髓腔内容物至分散均匀，将骨髓冲洗液用0.22 μm滤器过滤，得到骨髓单细胞悬液。1:1比例将淋巴细胞分离液与单细胞悬液依次加入离心管中，室温1400 rpm离心30 min。吸出骨髓单个核细胞层与EGM-2培养基重悬，室温1000 rpm离心10 min洗涤2遍。然后将骨髓单个核细胞接种于纤维蛋白包被的培养皿上培养12 h。首次更换培养基轻摇培养皿，将未贴壁细胞重新接种于另一纤维蛋白包被的培养皿上，换液步骤同原培养皿。以后每24 h更换一次培养基，在此过程中将非EPCs集落刮除，待细胞融合至80%时进行传代。1.3 EPCs吞噬功能鉴定 通过吞噬结合实验鉴定EPCs吞噬Dil-acLDL与FITC-UEA-I结合的特性。将生长状态良好的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化，吹散细胞使之变为单细胞悬液。胎牛血清中和胰蛋白酶后，用EGM-2培养基调整细胞密度。24孔板每孔1×104个细胞制作爬片。细胞长至80%进行染色。稀释Dil-acLDL浓度至10 μg/ml，FITCUEA-I至20 μg/ml，同时加入孔板中，于细胞培养箱避光孵育4 h。预冷PBS浸洗10 min。用4%多聚甲醛4℃固定1 h。再用PBS浸洗3遍，每次10 min。封片后在激光共聚焦显微镜下任选5个视野，观察并计算荧光双染细胞数量。

1.4 EPCs增殖能力检测及绘制生长曲线 CCK-8试剂盒检测EPCs在不同浓度葡萄糖中的增殖能力。将EPCs分为5组，EGM-2培养基含有5 mM葡萄糖，将5 mM组设为对照组，添加葡萄糖使10 mM组、15 mM组、20 mM组、25 mM组达到相应的浓度，每组设置3个复孔，共观察72 h。每12 h检测一次，将原培养基去除后，1:10的比例加入CCK-8与新培养基，避光孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.5 EPCs迁移能力检测 通过Transwell实验检测EPCs在不同浓度葡萄糖条件下的迁移能力。Transwell小室中加入培养基平衡1 h，每孔1×104个细胞用无FBS的EGM-2培养基重悬后加入上室，下室加入含有10% FBS及不同浓度葡萄糖的EGM-2培养基。将小室放入细胞培养箱培养24 h后，未迁移至下室的细胞用棉签轻轻擦去。下室细胞用4%多聚甲醛固定1 h，PBS洗涤3遍。最后用结晶紫染色，倒置显微镜下任选5个视野观察并计数。

1.6 EPCs体外血管形成能力检测 于使用前一晚将基质胶放入冰箱中使之融化。96孔板每孔加入100 μl基质胶，放入细胞培养箱使之凝固，然后每孔加入1×104个细胞，放入培养箱培养24 h后，于倒置显微镜下观察并计算新生管壁的长度。

1.7 统计学分析 使用SPSS 17.0统计软件处理所有的数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠EPCs形态学观察 大鼠骨髓来源原代EPCs培养12 h后，第一次换液，贴壁细胞呈类圆形，细胞体积小（图1A）。细胞培养7 d后，倒置显微镜下观察，细胞两端逐渐伸出伪足，细胞体积增大，呈纺锤形集落分布（图1B）。继续培养至14 d，细胞紧密排列，呈典型的铺路石样分布（图1C），细胞融合成片，为三角或多边形（图1D）。培养过程中不断清除非EPCs集落。2.2 大鼠EPCs鉴定 于激光共聚焦显微镜下观察，吞噬Dil-acLDL后EPCs呈现红色（图2A），特异性结合FITC-UEA-I后EPCs呈绿色（图2B）。将图片融合后显示黄色的为EPCs（图2C），阳性率为（93.10±0.85）%。阴性对照细胞未能观察到荧光。

图1 大鼠原代EPCs形态学观察

图2 大鼠EPCs鉴定

2.3 不同浓度葡萄糖对EPCs增殖能力的影响 各组细胞葡萄糖干预后，每12 h测量一次吸光度值并绘制生长曲线。结果显示，同一时间点随着葡萄糖浓度升高，吸光度值降低，增殖下降，培养72 h后，在25 mM达到最大抑制程度。同一浓度，12 h开始进入对数生长期，48 h进入平台期（图3）。

图3 不同浓度葡萄糖对EPCs增殖的影响

2.4 不同浓度葡萄糖对EPCs迁移能力的影响 随着葡萄糖浓度的升高，迁移至下室EPCs比例逐渐减少（5 mM：1.00±0.05；10 mM：0.68±0.06；15 mM：0.56±0.03；20 mM：0.40±0.04；25 mM：0.23±0.03）（图4A～E），与5 mM组对比，25 mM组迁移比例最低[（0.23±0.03） vs .（1.00±0.05）]，差异有统计学意义（P＜0.01）（图4F）。说明高糖抑制EPCs的迁移能力，且25 mM浓度时抑制最明显。

2.5 不同浓度葡萄糖对EPCs体外血管形成能力的影响 随着葡萄糖浓度升高，体外血管形成能力逐渐降低，5 mM所形成管腔完整，至25 mM浓度时已基本不能形成完整管腔（5 mM：1.00±0.04；10 mM：0.81±0.04；15 mM：0.70±0.04；20 mM：0.63±0.03；25 mM：0.56±0.03）（图5A～E）。与5 mM组对比，25 mM组血管形成抑制作用最明显[（0.56±0.03） vs. （1.00±0.04）]，差异有统计学意义（P＜0.01），说明高糖抑制EPCs体外血管形成能力，且在25 mM时最明显（图5F）。

3 讨论

图4 EPCs在不同浓度葡萄糖中的迁移能力

图5 EPCs在不同浓度葡萄糖条件下的体外血管形成能力

糖尿病不仅增加心血管并发症、心血管疾病早期死亡以及致残率，还加重社会经济负担[7]。研究发现糖尿病是动脉粥样硬化、慢性肾脏衰竭、心力衰竭的病因[8-10]。本研究首先对EPCs形态学进行观察以及鉴定，然后观察不同浓度葡萄糖对EPCs的影响。为后续EPCs在高糖环境下的病理生理机制探究提供合适浓度。

骨髓和外周血来源的EPCs在内皮修复、血管生成、血管新生和改善血管功能中起关键作用。EPCs是内源性修复系统的一个重要组成部分[11]，对心血管系统有重要保护作用[12]，EPCs在特定刺激下被动员或释放到血液循环中，通过旁分泌调控，参与血管形成和内皮修复[13,14]。

EPCs参与维持心血管稳态，其衰竭或功能障碍可能加速糖尿病相关心血管并发症的发生。EPCs参与维持心血管损伤和修复间的平衡，对于维持心脏重塑、心功能、内膜完整性、内皮功能和预防心血管并发症至关重要[15]。高糖环境的EPCs病理生理研究是目前研究热点。EPCs的迁移和血管新生能力在修复损伤方面十分重要[16]。

因此，本研究探究不同浓度葡萄糖对EPCs增殖、迁移及体外血管形成能力的影响，结果发现，随着葡萄糖浓度的升高，无论是EPCs迁移能力，还是体外血管形成能力均被抑制，25mM时抑制达到最高程度，为后续建立高糖模型提供了理论与技术支持。

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