人参果茎尖脱毒与组培快繁技术研究

张丽芳　李荣琼　包涛　李国昌　施林　蒋瑜　杨春利

人参果（Solanum muricatumAiton）原名为香瓜茄，又名香艳梨、艳果，属茄科蔬菜、水果兼观赏型草本植物。其成熟的果实呈奶油色或米黄色带紫色条纹，呈椭圆形、卵圆形、心形或陀螺形。果肉为淡黄色，清香多汁，腹内无核，风味独特，可食率达95%以上，具有高蛋白、低脂肪、低糖等特点，富含钙、维生素C、钼、钴、硒等几十种人体所需的微量元素，尤其是硒、钙的含量大大高于其他的水果和蔬菜[1]，具有抗癌、抗衰老、降血压、降血糖、消炎、补钙、美容等功效，是一种较受欢迎的鲜食水果，也可作为蔬菜食用，人参果亦具有极高的观赏价值，可作盆景在庭院、阳台或房前屋后栽培。

人参果曾被医学界称为“生命之火”、“抗癌之王”[2，3]。近些年来，由于农业产业结构的调整和发展高原特色农业的要求，人参果作为高原特色水果在云南各地发展迅速，种植面积不断扩大。人参果常规繁殖是采用种子和扦插2种方法，但7～9月高温期结的果中没有种子，适温期结的果中有少量的种子，但种子的发芽率较低，因此，在人参果种植区域，多采用扦插育苗，农户连年自留种自繁自用，这种无性繁殖容易导致病毒在种植过程中传播和积累，加重了病毒病的发病几率和为害程度，严重影响了人参果的产量和品质，制约了人参果的种植发展。通过植物组织培养技术进行茎尖脱毒，可解决植物病毒引起的退化问题，恢复品种原有的优良特性，用组培快繁技术进行工厂化生产获得大量脱毒组培苗，能满足生产中对优质种苗的需要。

1　材料与方法

1.1　试验材料

从昆明市石林县西街口镇人参果种植地中选择生长势强、植物学特性明显、无病虫害的植株，剪取生长充实的新发枝条作为试验材料。

1.2　试验方法

①外植体的选择与处理将从石林西街口镇采来的人参果枝条进行修剪，切取枝条顶端3～4 cm长的顶芽，用自来水冲洗30 min，在超净工作台上进行消毒处理。先用剪刀将顶芽下的2～3台较大叶片剪除，用70%酒精处理30 s，无菌水冲洗2次，然后放入已消毒的瓶中，再用0.1%的升汞浸泡10 min，浸泡时不间断摇荡瓶子，以确保外植体得到全面彻底的消毒，最后用无菌水反复冲洗5次。

②茎尖的剥取和无菌接种在双筒解剖镜下由外向内逐层剥去幼叶，直至半球体顶端分生组织充分暴露出来，迅速切取0.2～0.4 mm茎尖，快速接种于茎尖诱导培养基上。诱导培养基为：a.MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L；b.MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L；c.MS+6-BA 0.20 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L。

③茎尖分生组织培养和病毒检测茎尖分生组织在诱导培养基上培养3～4周后，明显长大，然后转入a培养基培养1～2个月，长成完整的小植株。将所获得的小植株进行病毒检测，即抽提样品负染色制片，JEM100CX-Ⅱ透射电子显微镜检测。

④继代增殖和生根将经检测后的不带病毒的核心苗剪成带1～2节的茎段，接种于继代增殖培养基上。继代增殖培养基为不加任何激素的MS培养基 和 MS+6-BA（0.05～0.2 mg/L）+NAA（0.01～0.05 mg/L）+GA30.1 mg/L，以上培养基均添加3%蔗糖（或食用白糖），用6.5 g/L琼脂粉固化，pH值5.8，分装于玻璃瓶中，每瓶注入40 mL培养基。培养条件：光照 2 000～3 000 lx，12 h/d，温度（25±2）℃。

⑤组培苗的驯化和移栽带节茎段经过25～30 d培养，长至6 cm左右，有6～7台叶片的完整植株时，打开瓶口炼苗1～2 d，然后取出苗后洗净其根部的培养基，移栽到装有草炭土或过筛腐叶土的漂盘中，放置于漂池内，移栽初期，漂池要套小拱棚。温度保持15～25℃，相对湿度85%～90%，适当遮荫，后期逐渐通风，增强光照。经炼苗30～40 d，根系能够拢住基质坨，苗高15～20 cm时可移栽大田。

2　结果与分析

2.1　核心苗的获得

将茎尖生长点接种于a、b及c 3种诱导培养基上，在培养基a上，15 d后生长点明显长大变绿，30 d左右可长成0.5 cm小芽，45～50 d可长成具有2～3个茎节的完整植株。培养基b上的生长点培养30 d左右，愈伤组织膨大，继续培养至60 d左右，从愈伤组织上形成小芽点，之后再缓慢长成完整植株。培养基c上的生长点比b上的愈伤组织更严重，成苗更慢。所以适宜的人参果茎尖生长点诱导成苗培养基为：MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L。外植体通过消毒后剥取茎尖生长点，经诱导培养，成苗率28%。随机抽取植株进行病毒检测，JEM100CX-Ⅱ透射电子显微镜5万倍下平均每视野未观察到病毒粒体，即被确认为不带病毒，可作为脱毒核心种苗。脱毒成功率较低，一般只有5%左右。

2.2　继代培养与快速繁殖

将经检测后的不带病毒的核心苗剪成带1～2节的茎段，接种于不加任何激素的MS培养基与添加不同浓度 6-BA（0.05～0.2 mg/L）、NAA（0.01～0.1 mg/L）和 GA30.1 mg/L的 MS培养基上培养25 d，观察苗的生长情况。结果表明，在不加任何激素的MS培养基，带节茎段接入7 d左右每段有1～2条新根长出，顶芽段已明显长高，中间茎段的腋芽已经萌出，由茎段变成完整的植株。随着培养时间的延长，植株长高、根系增多。培养25 d后，每株高达 6～7 cm，有 7～8 片叶，根系 4～6 条，叶色浓绿，茎秆粗壮。在添加激素的培养基上，当6-BA和GA3浓度一定，NAA为0.01 mg/L时，带节茎段的生根要比不加任何激素的MS培养基早2 d，茎段接入5 d时已有根长出，每茎段长根2～3条。随NAA浓度的提高，生根变慢，茎段基部长出愈伤组织。NAA浓度越高，生根越慢，愈伤越严重。当NAA和GA3浓度一定，6-BA浓度为0.05 mg/L时，植株生长势最强，随6-BA浓度的提高，植株长到 3～4 cm时，出现分枝现象，即从植株基部往上第2～3个茎节处长出侧芽，每株分出1～2个分枝，植株分枝后，主干几乎停止长高，侧芽继续生长，但长势细弱。所以适宜的人参果继代快繁的培养基为：不加任何激素的MS培养基或MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L。

人参果组培每个增殖周期一般为25～30 d，增殖倍数4～5倍。经过几个继代周期后，数以万计的脱毒优质人参果苗即可长成。

2.3　生根培养

人参果组培苗的生根较容易，带节茎段在萌芽长高的同时长出根系，增殖和生根同步进行，一次成苗，不需要单独进行生根阶段。

2.4　组培苗的移栽

人参果组培苗移栽前首先在温室中自然光条件下炼苗1～2 d，再从瓶中取出小苗，用自来水洗净附在苗上的培养基，移栽于基质为草炭土或过筛的腐叶土的漂盘中，移栽好的漂盘放置于漂池内，移栽后一周内盖小拱棚保湿并加盖遮阳网，30 d后观察组培苗的生长情况和统计移栽成活率。草炭土和过筛的腐叶土2种不同的基质上苗的成活率没有明显的区别，都超过94%，但是草炭土上苗的长势明显优于腐叶土，草炭土上的苗平均株高比腐叶土上的多1.6 cm，苗的颜色浓绿，叶片大，根更发达。试管苗经过40 d左右炼苗后，就可以移栽到大田了。

3　讨论与结论

人参果的脱毒过程中，通过直接从植株上选取新发枝条作为剥取茎尖生长点的外植体，这样做不仅需要大量的外植体材料，而且脱毒率也较低，只有5%左右。用植株上剪取的枝条经消毒处理后，切成带节茎段直接接种于不加激素的MS培养基或MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L上，培养成完整的植株（无菌苗）。把无菌苗剪成带节茎段，在同一培养基上继代2～3个周期，等无菌苗繁殖到一定数量后，再用这些无菌苗的顶芽来剥取生长点并培养成完整的植株，随机抽取生长点长成的植株进行病毒检测，不带病毒的植株即可作为核心种苗来快繁。这种先经过无菌苗培养后再用无菌苗脱毒的方法，剥取生长点较容易，成苗率高，脱毒率也高。

人参果组培苗继代快繁过程中对激素的需求不明显，植株在无激素的MS培养基中就能长得很好。6-BA和NAA的浓度直接影响茎段长成完整植株的速度和质量。在6-BA浓度一定的情况下，NAA浓度超过0.01 mg/L时，随着浓度增加，茎基部接触培养基部分出现白色疏松愈伤组织越多，植株长势变慢。当NAA浓度为0.01 mg/L时，6-BA浓度超过0.05 mg/L，随着6-BA浓度增加，植株分杈增多，主茎生长变慢，甚至顶芽干枯坏死，枝干和叶片变脆。因此，适宜人参果继代快繁的培养基为不加任何激素的MS培养基或低浓度的6-BA和NAA配比。

[1]李荣琼，李国昌.云南高原特色人参果无公害生产技术[M].昆明：云南科技出版社，2014：1-3.

[2]陈健，管其宽.人参果栽培与利用[M].北京：金盾出版社，2002：3.

[3]符伟玉，张建和.香瓜茄微量元素含量的分析[J].广州微量元素科学，2004，11（8）：51-53.