微流控技术在病原学检测中的应用综述

宋波　王桥　张晓杰

【摘要】微流控芯片，又称芯片实验室，是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的技术平台，微流控技术是一个由物理、化学、微加工技术与生物技术等学科组成的交叉领域，微型化、集成化的微流控芯片具有高效、快速、样品和试剂用量少等优点，促进了其在病原体检测中的应用。对传统方法以及微流控芯片在病原体检测中的应用进行综述，并提出了微流控技术研究的优势。

【关键词】微流控芯片 病原体 检测微流控芯片，也被称为微全分析系统，是将常规实验室中的加样、反应、分离检测等基本操作在一块几平方厘米（甚至更小）的芯片上进行的方法，可以取代常规生物或化学实验室各种功能的一种高新技术平台。本文将现有病原微生物检测方法与微流控芯片方法进行对比，针对该领域在病原微生物检测方面的主要研究难点和发展趋势进行了讨论。

一、现有的微生物检测技术

病原微生物的检测标准是培养法，此法简单、直观、费用低，但该法耗时、操作繁琐、灵敏性低，对操作人员要求高。免疫分选技术是利用抗原-抗体的特异性反应，在检测微生物中应用非常广泛，可定量检测样本中的微生物，但该法仍存在耗时、操作繁琐、试剂耗量大的缺点，不能满足临床对感染性疾病快速诊断的需求。

聚合酶链反应（PCR）等分子生物学检测法具有高度的特异性和灵敏度，检测特异性基因片段从而达到多种病原菌的鉴定的目的，但本法存在过度敏感，假阳性率高，较复杂的样本需要预处理等缺点，准确性和特异性不高。

二、微流控芯片技术中常用的病原菌检测分析技术

1.免疫分选技术

将免疫分选与微流控芯片技术结合是近年来的研究热点，该法反应体积在微升级，样品和试剂耗量减少，提高了分选效率，芯片全程可控，简化了操作流程，样品扩散距离缩短，节省了反应时间，其高通量、高集成的特点，实现了对不同目标菌的特异性分选和富集。

免疫分选技术主要包括三种方法：微通道免疫分选、免疫微珠分选和免疫磁珠分选。

微通道免疫分选是在微通道内壁表面使用物理吸附或化学结合的方法固定抗体或其类似物，再向芯片内加入待检样品，实现微生物的特异性捕获检测。Boehm等设计并制作了了微流控生物传感器，在芯片上多个微室表面上修饰不同的特异性抗体，从而达到了同时检测不同种类微生物的目的。该法的缺点是处理步骤较繁琐，分选效率较低。

免疫微珠分选技术使用玻璃微珠进行特异性抗体吸附，Varshney等设计微通道深度与微珠直径尺寸相近，使得微珠在微通道中单层排列，将捕获有大肠杆菌特异性抗体的免疫微珠填充于微通道中，利用化学发光法检测微珠表面的大肠杆菌含量。由于微珠有更大的比表面积，因此能将更多的特异性抗体固定于一定表面上。但本法为了有效防止微珠在腔内重叠造成光信号的阻滞，微珠必须呈单层排列，因此芯片的制备具有一定的难度。

免疫磁分选技术利用安装于微通道附近的电磁场发生器俘获磁珠，较微珠分选法更具自动化和灵活性。Pivetal等设计一个 S型微通道的芯片，在磁珠表面上修饰特异性抗体，对样本中目标微生物的检测率达到了 98.46%。本法的缺点是，磁珠价格昂贵，实验需要产生磁场的装置，因此本研究并不利于批量生产，限制了其发展成为临床即时检测设备。

2.基于核酸的荧光检测

本法将PCR与微流控芯片结合，将自动变温的加热器集成在微型反应室上，实现样品液在特定反应室中变性、退火和延伸，通过对扩增产物荧光标记，实现对待检菌特异片段的实时定量分析。Lee通过这种方法完成登革热病毒、肠道病毒71的分选和RNA病毒的检测，检测限可达到10-102PFU/m L。该方法虽然特异性和灵敏度很高，但对核酸蛋白质的直接检测鉴定更具有说服力。

三、展望

微流控芯片集成度高、准确性好、试剂消耗低、反应速度快，其要素涵盖小型化实验的基本过程，如样品分离、纯化、试剂混合、探针杂交或合成以及样品检测等。随着新技术的发展和信息化水平的提高，微加工技术的迅速发展，微流控芯片发展成为即时检测和诊断仪器将成为极大的可能，在临床病原体的早期诊断及药敏试验等应用中，具有极大的潜力。

此外，微流控芯片即时检测仪器的检测诊断对象由现有的血糖、肺结核、HIV、心脏标志物等向外大幅延拓，有望覆盖体育竞技、海关口岸、应急辅助医疗等诸多领域，这项技术未来将发展成为检验科最重要的研究方法之一。

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