柞蚕核型多角体病主要防治技术概述＊

吕 银，程 明，柯皓天，刘 玲，陈祥平，范小敏

（1.四川省丝绸科学研究院，四川 成都 610031；2.四川省丝绸工程技术研究中心，四川 成都 610031；3.四川省丝绸协会，四川 成都 610031）

柞蚕（Antheraea pernyi）属昆虫纲、鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属的吐丝昆虫，我国柞蚕、柞树资源丰富，柞蚕鲜茧产量约占全世界总产量的90%以上，经济价值大。柞蚕核型多角体病又称柞蚕脓病，是柞蚕生产的主要病害之一，由于各地发病时期和症状不尽相同，也称嫩起子、水眠子、半蜕皮、老虎蚕、黄烂皮、油烂茧以及里倒山等。该病发生广泛，我国辽宁、吉林、黑龙江、河南、山东、四川等柞蚕产区及国外饲养柞蚕区都有发生，一般年份的发病在10%左右，严重时达50%以上，危害严重。一直来对柞蚕核型多角体病主要从改善放养环境和养蚕技术上加以防治，上世纪60年代后，科技工作者开始从传染途径、发病机理和消毒措施等方面进行综合防治研究。

李光泽等研究ApNPV感染潜隐期，发现蚁蚕感染多角体病毒，主要在1龄、2龄发病；蚁蚕食下经药剂或自然致弱的多角体病毒后，潜伏期显著延长，到4龄、5龄开始发病；将游离病毒接种蛹体，病毒增殖可分四个时期：减少期、潜隐期、高速增殖期和平稳期，25℃下潜隐期为8 d，但经0.5%福尔马林致弱处理，其潜隐期延长为17 d。

李光泽等研究柞蚕消化液对多角体病毒的灭活作用，发现柞蚕消化液是ApNPV感染的主要防御物质，游离态病毒在消化液中10 min便失去活性，多角体病毒在消化液中120 min失去活性，其消化液的灭活力随柞蚕龄期的增进而逐渐提高；柞蚕经0～5℃低温处理48 h后，消化液对病毒的灭活力明显降低，如处理后移至常温下，则消化液的灭活力逐渐恢复，24 h后基本恢复；起蚕经40℃以上高温处理4 h，消化液的灭活力也显著降低，盛食期影响较小；蚕大量喝水也能降低消化液对病毒的灭活力；消化液中某种物质对病毒的灭活起主要作用，消化液离体于60℃以上高温下处理1 h则这种物质完全失去活性，于室温下放置24 h则其活性明显降低，但低温（-35℃）处理对其活性影响不大。柞蚕核型多角体病的传染途径主要为经口食下传染和体壁创伤染，切断其传染途径是预防该病发生的关键。给柞蚕体接种福尔马林死毒疫苗，因为柞蚕体本身没有完整有免疫系统，其保护指数在0.5以下，此防治技术无应用价值；先后筛选上百种抗病毒药剂，仅有肽丁胺等少数几种有一定的治疗效果，但治愈率只有30%左右，所以药物治疗也不实用；根据病原特性及传染机制，采用消毒防病的措施，取得了很好防治效果。

随着新技术和抗病品种的推广应用，柞蚕核型多角体病的发病率基本控制在10%以下，但近几年来，四川蚕区柞蚕核型多角体病又出现起伏，甚至有上升的趋势。

1 柞蚕核型多角体病毒特征及传染途径

柞蚕核型多角体病的病原为杆状病毒科（Baculovirudae）、核型多角体病毒属（Alphabaculovirus）的柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus，ApNPV）。ApNPV有两种存在形式，一种是多角体病毒，病毒粒子包埋在多角体中，另一种是游离态病毒，没有多角体包被的裸露病毒。

1.1 多角体病毒

多角体在光学显微镜下呈三角形、四角形或不规则形，具有较强的折光性和淡青色荧光；在电子显微镜下大多呈为三角形四面体、四角形六面体及不规则体。多角体的蛋白晶格具有高度规则性，排列均一、整齐。多角体大小因宿主龄期和组织的不同存在差异，在0.7 μm～10 μm间。1～2龄蚕体内形成的多角体较小，4～5龄蚕体内形成的多角体较大。同一组织不同细胞内形成的多角体大小也存在差异，但同一细胞内多角体的大小基本一致，一个细胞内多角体数量越多则多角体就越小，反之亦然。成熟多角体的表面多光滑致密，不成熟多角体的表面多凹凸不平，处在裂解期多角体的表面呈纵横饰纹或瓦棱状。多角体本身不具备致病能力，但包埋内的病毒可借助其保护而长时间保持致病能力。

1.2 游离态病毒

游离态病毒体积小，只有在电子显微镜下才能看到，所以游离态病毒能通过细菌滤过器，因此也称滤过性病毒。ApNPV粒子多呈杆状，大小约为55 μm×350 μm，紫外检测属典型的昆虫杆状病毒。成熟的ApNPV粒子被双层膜包裹，发育膜在最外层，内膜为紧贴病毒体和发育膜的一层薄膜，封堵在多角体内的的ApNPV粒子常常形成整齐排列的病毒束。自然状态下病毒粒子可经口或通过体壁创伤口引起感染，ApNPV感染组织细胞时，便释放出核酸而留下外壳，核酸为双链环状脱氧核糖核酸，约130 kb，可复制、增殖，具有感染性，蛋白质外壳不具有致病能力。病毒粒子的其中一端有一个吸附装置的突起，在病毒侵染时发挥作用。当柞蚕感染ApNPV后，在细胞核内形成一种特异的产物即多角体，在多角体内包埋许多具有致病能力的病毒粒子。

1.3 传染途径

柞蚕核型多角体病是一种急性传染病，多角体病毒和游离病毒都能经食下传染和创伤传染引起该病的发生，而游离病毒只能经创伤传染引起该病的发生。ApNPV附着在柞蚕卵面或新鲜柞叶上，随蚁蚕孵化或者幼虫食叶而进入蚕中肠，碱性消化液将多角体溶解后释放出病毒粒子；一部分病毒粒子脱去囊膜和核衣壳后进入中肠细胞，核酸在细胞核内进行复制，但只有少数会形成多角体态病毒，另外部分病毒粒子进入体腔后随血液循环而侵入脂肪体、血细胞、气管上皮细胞、体壁真皮细胞等，在细胞核内复制、增殖，形成多角体；随着不断的增值，细胞核也不断变大，直到整个细胞核充满了多角体，细胞核乃至整个细胞被多角体撑破；以上就是食下传染，是该病的主要传染途径。此外，因在收蚁和养蚕过程中的匀蚕、移蚕等操作不当，造成幼虫体壁创伤，也能引起游离病毒的创伤传染而发病。

王林美等研究ApNPV对柞蚕蛹卵巢细胞的感染性，发现在倒置显微镜下，柞蚕蛹卵巢细胞被Ap-NPV感染5 d后，细胞内开始有多角体病毒出现，细胞开始变得胀大，被感染7 d后，多角体数量显著增多，此时培养细胞的上清液中检测到包涵体病毒效价浓度为6.95×105TCID50/mL；在电子显微镜下，细胞早期的表现为细胞核逐渐膨大，随后在细胞核内检测到核衣壳和病毒发生基质，然后形成病毒束，成为成熟的病毒粒子，一个多角体中包埋有多个病毒粒子，多角体具有强折光性，直径在0.7 μm～10 μm；ApNPV对柞蚕蛹卵巢细胞敏感度较高，为典型的杆状病毒复制。

2 柞蚕核型多角体病的发病症状

柞蚕核型多角体病主要发生在蚕期和蛹期，其典型症状是：蚕体肿胀，体皮变色并质脆易破，化脓腐烂。由于蚕的发育时期不同，病蚕表现出来的症状也有明显差异。

2.1 幼虫期病症

柞蚕核型多角体病在1龄期发病较少，多发生在2龄、3龄眠中或眠起时，俗称“水眠子”，表现为病蚕体壁柔软、体节肿胀、体色变黄、体腔内血淋巴增多，通常用腹足及尾足抱住柞树枝条，头部下垂，随着病势发展，体壁逐渐溃烂，流脓而死。指蚕染病后，在眠起蜕皮时旧皮脱下一部分，有的仅蜕下一半旧表皮，呈半蜕皮蚕，多倒挂于柞树枝叶而死，表现为“半蜕皮”。“嫩起子”指病蚕眠起蜕皮后，体壁柔软不硬化，体色暗淡，体节肿胀，有时尾部的三角板变成黑褐色，随着病情发展，体壁逐渐破裂，流脓而死。“黄烂皮”多发生在3～5龄，病蚕初期体色变淡，皮下、脂肪体等组织开始溃烂，混浊呈豆腐脑状，随着病势加重，体壁逐渐破裂、流脓而死。“老虎蚕”多发生在5龄盛食期至营茧前，病蚕初期体节肿胀，背部疣状突起和气门线下疣状突起部位可见褐色、灰色的小斑点，由小变大，形成黑褐色病斑，形如虎皮斑纹，故称老虎蚕，随着病势加重，病斑处逐渐破裂，流脓而死。“油烂茧”指一部分患病较轻的蚕可吐丝结茧，有的蚕只吐出一部分丝，死于茧壳内，尸体逐渐溃烂，流出脓汁污染茧壳呈黑褐色，也称“里倒山”。

2.2 蛹期病症

柞蚕在4龄、5龄感染ApNPV，可能延迟至蛹期发病，病蛹症状为：体色浑暗，蛹皮脆弱，颅顶板变成黑灰色或灰褐色，稍经触动即破裂而流出脓汁，流出的脓汁浸透茧壳，成为油烂茧状。有的病蛹、脓汁在茧壳内慢慢阴干，整个茧变得很轻，而称为“空瓤茧”。

3 防治措施

柞蚕核型多角体病属强烈的传染性疾病，必须从阻断传染途径、增强蚕抵抗力以及改善放养条件等多方面综合施策，才能取得良好的防治效果。朱有敏等研究柞蚕对ApNPV感染的抵抗性与部分生命力性状的相关性，发现孵化率与稚蚕对ApNPV感染的抵抗力呈显著正相关，其相关系数为0.71，而与5龄壮蚕对ApNPV感染的抵抗力及自然发病率相关关系不显著；5龄壮蚕对ApNPV感染的抵抗性与5龄壮蚕感染ApNPV后的虫蛹统一生命率相关系数为0.98，呈显著正相关；柞蚕品种对ApNPV的抗性，应依据稚蚕期和5龄壮蚕期2个发育阶段对病毒感染的抵抗性来进行综合鉴定。

贾姝等分析ApNPV侵染对柞蚕幼虫体内部分保护酶活性的影响，发现柞蚕幼虫被ApNPV侵染后，其血淋巴中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性逐渐升高，分别在接种后第3天、第4天达到最大值，分别是573.97 U/（mL·min）、0.11 U/（mL·min），之后又逐渐下降；血淋巴中的过氧化氢酶（CAT）活性则表现出先降低后升高的变化趋势，接种后第5天达到峰值378.44 U/（mL·min），之后又逐渐下降；在柞蚕对ApNPV的免疫防御过程中，POD、SOD首先作出应答反应，CAT其后作出应答反应，且试验组幼虫血淋巴中的POD活性始终高于发育同期的对照组幼虫，推测POD是起主要作用的保护酶。

3.1 消灭病毒，切断传染途径

柞蚕核型多角体病发生的主要原因为病毒感染，其中卵面感染和1龄、2龄小蚕期感染最为重要。因此，严格消毒，彻底消灭病毒，是预防该病发生的关键。蚕室、蚕具用3%甲醛溶液喷雾消毒或毒消散（5 g/m3）熏蒸消毒，密封24 h后通风，周围环境及走廊通道用5%石灰水喷洒或生石灰粉消毒。蚕具也可单独用石灰水浸泡或用甲醛与高锰酸钾作用产生的气体消毒。卵面消毒在春季一般先用0.5%～0.8%氢氧化钠洗卵1 min，然后再用10%盐酸浸卵10 min，或者用3%甲醛（盐酸甲醛混合液）浸泡30 min（24±1℃）；在秋季直接用3%甲醛（盐酸甲醛混合液）浸泡30 min（24±1℃），或用甲醛与高锰酸钾（100 mL：60 g）混合产生的甲醛气体消毒60 min；为了防止卵面消毒后的再感染，消毒后的蚕卵应及时送到山上蚕场或保存在无毒保卵室内阴干，进入保卵室的人员要防止带入病毒，没有条件建立保卵室的，可直接放入保卵盒，或放在无污染、未堆过茧、未制过种的洁净房屋保卵。

3.2 及时收蚁，防治抓伤传染

小蚕相互抓伤而发生创伤传染是柞蚕核型多角体病发生的主要原因之一。春蚕期多在室内暖卵，一般黎明时孵化，很难做到及时收蚁。为了改变这种状况，可以在孵化前一天晚上，将卵拿至室外，24 h左右再拿回室内，这样孵化时间将推迟到早上7时左右，边出蚕边收蚁，可以避免小蚕成堆，互相抓伤，每天重复，直至全部孵化。秋蚕期孵化时温度较高，更要掌握好孵化时间，同时严格消毒，按时收蚁，及时上山。

3.3 加强养蚕管理，防止蚕期扩大传染

科学养蚕，及时匀蚕、移蚕，使蚕良叶饱食。选用上年未发病或发病较轻的柞园饲养春蚕。蚕期严禁搂草，防止尘土污染，避免雨天、大雾天或中午温度较高时移蚕，小蚕期抵抗外界恶劣环境能力较差，可采取适当的保护措施。发现病蚕及时淘汰，集中深埋或烧毁；防止病蚕污染柞叶、蚕具、人体以扩大传染。夏季应避免雨天摘茧，需适时摘茧、随摘随剥、及时穿挂，避免种茧堆放，发现油烂茧及时挑出并销毁或深埋。应加强种茧、种卵保护，保持适当的温湿度。

3.4 推广抗病品种及杂交种

提高柞蚕对核型多角体病毒的抵抗能力以及选育高抗品种，是防治柞蚕核型多角体病的有效措施之一。选择抗病性强和上代放养精细、发育健壮、发病较轻的蚕种进行放养，生产上推广应用抗病品种和杂交种，可一定程度减少发病，提高产量、增加收益。

4 柞蚕核型多角体病的分子生物学研究

柞蚕属野外放养的泌丝昆虫，具有蛹体较大、以蛹越冬、方便保存、容易固定、保存时间长且便于运输等特性。利用柞蚕蛹作为生物反应器生产功能性蛋白质，既能大规模机械化生产，又能有效降低劳动强度以及减少操作上的烦琐。黄元姣等用ApNPV载体表达系统，将BO半乳糖苷酶基因（LacZ）在柞蚕培养细胞（AnPe细胞）中实现成功表达，同时通过进行筛选、纯化，获得了AnpeLacZ重组病毒。贾平骜等利用BLAST软件在线检索ApNPV特异基因ORF142的序列后，设计了引物AP1，对ApNPV基因组DNA进行了PCR扩增，获得大约130 bp的DNA片段，其病毒DNA最低检测浓度为0.5 fg/mL，用该方法检测ApNPV快速而方便，且添毒浓度与感染后的检出时间呈正相关。

病毒microRNAs（VmiRNA）是病毒基因组编码的一种小RNA分子，在病毒侵染宿主以及病毒繁殖过程中发挥作用。李文利等采用现代分子测序技术检测柞蚕被ApNPV感染后的病毒microRNAs含量变化，并用计算机分析技术预测ApNPV基因编码的VmiRNA前体序列，结果从被ApNPV感染的柞蚕蛹脂肪体中扩增出13条预测前体序列，且在病毒基因组中可以找到10条同源序列；利用荧光定量PCR技术证明有9条同源序列能够扩增出相应大小的基因片段，初步确认这是由病毒基因组编码的VmiRNA成熟序列；利用靶基因在线预测程序RNAhybrid预测，获得这些VmiRNA作用的135个可能的靶向基因，其中36个基因与免疫应答过程相关，19个基因与免疫系统进程相关，8个基因与免疫调节相关，9个基因与免疫系统发育相关，推测这些VmiRNA在病毒与宿主的相互作用中发挥着重要作用。

为探究ApNPV载体表达系统是否可用于表达哺乳动物活性蛋白，叶博等利用该表达系统表达医用蛋白人生长激素（hGH），发现柞蚕蛹感染重组病毒后7 d，体液中明显检测到hGH表达；之后hGH含量保持较高水平，重组hGH的最高表达量达到251.18 μg/mL；第15～20 d仍可检测到hGH表达，但表达产物开始降解；利用活化的人白血病细胞K562检测经ApNPV载体表达系统在蚕蛹内表达的重组hGH的体外活性，显示重组hGH对细胞K562的增殖具有显著的促进作用。为了探索ApNPV内源性非编码小RNA成熟体MD5对宿主靶基因的功能，宋丽新等利用现代生物信息学以及Solexa高通量测序技术，从ApNPV基因组中筛选、分离出成熟的MD5，通过GO数据库分析MD5对靶基因的功能，发现MD5调控的宿主靶基因在细胞内的分子结合、免疫反应以及酶催化中发挥作用，其中有4个靶基因与柞蚕免疫应答相关；荧光定量PCR检测MD5在脂肪体内表达上调，推测VmiRNA MD5在宿主柞蚕免疫相关基因的表达过程中扮演着重要角色。