OsCRY基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

庄春红　庄伟建

摘 要：蓝光受体隐花色素是主要的光受体之一，参与植物生长发育过程中一系列的生理生化及代谢反应。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2全基因的末端400bp到600bp，構建了pET-29a（+）-OsCRY1a、pET-29a（+）-OsCRY1b、pET-29a（+）-OsCRY2基因高效表达载体，并在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达，分别获得大约20-30kD的CRY融合蛋白，纯化了CRY融合蛋白，并制备了多克隆抗体。

关键词：隐花色素 融合蛋白 多克隆抗体

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2018）01-0-02

光受体在植物的光形态建成中起重要作用，参与植物生长发育过程中一系列的生理生化及代谢反应[1]。隐花色素是在所有主要的演化谱系上基因表达光调节的蓝光受体，但是其信号转导的分子机制仍然还没被完全揭示。光经过这些受体进行信号转导，引起生理生化反应，抑制下胚轴伸长、调节开花时间、气孔开放、刺激子叶扩展、引导昼夜节律时钟和调节基因表达等[2]，进而调节植物的生长发育，以更好适应外界环境。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2三个隐花色素基因末端400bp到600bp，构建基因高效表达载体，在大肠杆菌中诱导蛋白表达，纯化出融合蛋白，制备多克隆抗体，为后续隐花色素基因的利用和改造奠定基础。

一、材料与方法

1.材料

1.1菌种、质粒和培养基

大肠杆菌（ Escherichia coli）BL21和DH5α、质粒pET29a（+） 均由本实验室保存。LB 培养基：10 g·L - 1蛋白胨， 5 g·L - 1 NaCl， 5 g·L - 1酵母粉，pH 7. 0； 120 ℃高压灭菌20 min， 4 ℃保存备用。

1.2酶、生化试剂及试剂盒

Taq TM DNA聚合酶、胶回收试剂盒（ PCR Fragment Recovery Kit）及相关PCR引物购自上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶和T4 连接酶购自大连TaKaRa公司 ；Kan（卡那霉素） 、Amp （氨苄青霉素）、PMSF（苯甲基磺酰氟）来自美国AMERSCO公司；琼脂糖（Biowest agarose） 、质粒提取试剂盒（MediBEST Plasmid Purification Kit ）和Ni-NTA Superflow Cartridge购自Qiagen公司（上海） ；ECL检测试剂盒、 NC （硝酸纤维膜） 转印膜为GE 公司产品； IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）购自厦门星隆达化学试剂有限公司；弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂为北京鼎国公司产品；其余药品为国产分析纯生化试剂。

1.3实验动物

3只大耳成人家兔，体重约2 kg。

2.方法

2.1日本晴水稻基因组DNA的提取

用CTAB法[3]提取日本晴水稻基因组DNA。

2.2表达载体构建

以含有CRY1a、CRY1b、CRY2粳稻日本晴基因组DNA模板，Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物，PCR 扩增获得目的片段，回收产物经Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1双酶切后连入pET29a（+）表达载体，转入大肠杆菌DH5α，重组质粒鉴定后，送上海生工生物工程有限公司测序。引物序列如下：

Oscry1acctpET-Nde1： 5acta-CATATG-gactcct ccgacgtgcc gccgat 3

Oscry1acctpET-Xho1： 5acta-CTCGAG-GCCTTCTCTCCCAGTCCAGTTGCT 3

Oscry1bcctpET-Nde1： 5 Caac-CATATG-tcctcggag gttccaccaattg 3

Oscry1bcctpET-Eag1： 5Atta-CGGCCGa-CCAAACTGGGACTACGCCTC 3

Oscry2cctpET-Nde1： 5cgac-CATATGa-cagaatggat tcatcatcca tg 3

Oscry2cctpET-Xho1： 5 ctta-CTCGAG-TGCGGCTTTTCGTTGTCTTGA 3

2.3 融合蛋白的表达

将表达载体pET29a（+）-cry1a、pET29a（+）-cry1b、pET29a（+）-cry2转化大肠杆菌BL21表达菌株[4]，在平板（50 μg/mL Kan+）上筛选，挑取单克隆菌落，培养至对数生长期，测其OD值为0.5，加入IPTG诱导。4℃，5000rpm，离心10分钟，收集菌体，弃上清。1 mL 菌液沉淀用100μL上样缓冲液 （50mmol/Ltris-HCL（pH6.8）、 100mmol/L 二硫苏糖醇、2%SDS （电泳级）0.1%溴酚蓝、10%甘油） 重悬，煮沸4分钟，离心后上清液，多克隆抗体在12%SDS-PAGE中分离检测[5] 。

2.4融合蛋白的亲和纯化收集

100 mL 诱导表达后的菌体，离心收集沉淀。每克大肠杆菌中加3mlNPI-10（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer B（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH8.0）重悬沉淀，低温超声破碎。每克菌加入8ul 50mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）和8ul溶菌酶（10mg/ml），在4℃下20min内不时地进行搅拌。一边继续搅拌一边在每克大肠杆菌中加入4mg去氧胆酸[6]。放置悬浮液于37℃并用玻棒不时地搅拌。当裂解物变粘稠时，在每克大肠杆菌中加入20ul 核酸酶（1mg/ml），室温（25℃）贮藏直至裂解液不再粘稠。离心后，将上清载入Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱，用5倍柱体积NPI-20（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer C（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH6.3）冲洗3-5遍，再用NPI-250（50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH8.0）或Buffer E（8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl，pH4.5）洗脱。最后收集洗脱组分，利用12%SDS-PAGE 进行分离检测。

2.5多克隆抗体的制备

将100?g抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用并加入1ml弗氏不完全佐劑溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用5ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。将兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处[7]。在4个不同部位分别各注射约500?l抗原溶液。4-6周后再次注射抗原，并在注射后的7天-10天，每只兔子耳缘静脉取血0.5～1 mL，分离抗血清。[8]

二、结果与分析

1.三个CRY基因PCR扩增

以日本晴基因组DNA为模板， Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物进行PCR扩增，产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，且大小与预测基因一致，用胶回收试剂盒回收目标条带。

2.三个CRY基因表达载体的构建

质粒pET-29a（+）和目的片段酶切连接后，转化大肠杆菌DH5α。挑选单克隆进行振荡培养后，分别以Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物进行PCR扩增，筛选正确的克隆子。提取PCR检测阳性的克隆子重组质粒，以Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1进行双酶切验证（图1）。结果显示，三个重组质粒的双酶切产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测均有双条带，且大小与预期结果一致。重组质粒上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与已报道序列一致。

3.重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

三个重组质粒转化大肠杆菌BL21，转化菌培养至细胞密度（OD600）为0.5-0.6，加入终浓度为0.7 mmol·L - 1 IPTG进行诱导培养3-4小时。诱导后的细菌细胞煮沸后12% SDS-PAGE电泳，显示如图2。诱导后融合蛋白大小均在20-30KD，连接6个His标签。

4.融合蛋白的分离纯化

利用Qiagen公司的Ni-NTA Sp in Column进行三个CRY融合蛋白的分离纯化。用pH 7. 4的0. 05 mol·L - 1磷酸盐缓冲液（含0 - 0. 5 mol·L - 1咪唑）的进行梯度洗脱[9]，收集纯化的重组CRY蛋白，经SDS-PAGE检测 （图3）。纯化蛋白条带单一，其纯度高，可用于多克隆抗体的制备。

5.多克隆抗体特异性分析

将制备的多克隆抗体稀释7500倍，以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白为抗原（100ng）进行包被，三种多克隆抗体分别作为一抗，ELISA检测显示三种多克隆抗体分别有反应，且有交叉反应。以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白作为抗原（100ng），用三种多克隆抗体（1：500，1：2000，1：2000）进行点杂交，发现融合蛋白只与对应多克隆抗体有反应，证明由此方法得出结果的多克隆抗体特异。

三、结论

本研究构建了pET-29a（+）-OsCRY1a、pET-29a（+）-OsCRY1b、pET-29a（+）-OsCRY2三个高效表达载体，并在大肠杆菌中His诱导融合蛋白表达，分别获得大约20-30kD的CRY融合蛋白，并利用His标签纯化出特异的融合蛋白，免疫家兔后可获得较为特异的多克隆抗体。本研究为隐花色素转基因水稻的功能验证奠定基础，以期进一步深入了解水稻隐花色素基因各自的功能。

参考文献

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[2]李毓，庄伟建，庄春红，等.干扰隐花色素Cry1a与Cry1b基因的表达对水稻若干农艺性状的影响[J].福建农林大学学报（自然科学版）.2012，41（2） ： 153-158.

[3]王关林，方宏筠主编.植物基因工程（第二版），2002年8月.北京：科学出版社.742-746.

[4]李立芹.烟草WRKY12基因的分离、表达与多克隆抗体的制备 [J].核农学报，2011，25（3）：461-468.

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[7]CYP3A22 重组腺病毒载体构建与表达 [J].医药卫生，2016，05（29）： 284-284.

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[9]俞俞，邢卫锋，周茜，等. 拟南芥转录因子DYT1的原核表达与多克隆抗体制备 [J].西北植物学报，2011，31（2）：0261-0266.

作者简介：庄春红，福建惠安，汉族，1988年2月出生，微生物学硕士研究生，主要研究方向微生物方向。