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OsCRY基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

2018-03-22庄春红庄伟建

中文信息 2018年1期

庄春红 庄伟建

摘 要:蓝光受体隐花色素是主要的光受体之一,参与植物生长发育过程中一系列的生理生化及代谢反应。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2全基因的末端400bp到600bp,構建了pET-29a(+)-OsCRY1a、pET-29a(+)-OsCRY1b、pET-29a(+)-OsCRY2基因高效表达载体,并在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达,分别获得大约20-30kD的CRY融合蛋白,纯化了CRY融合蛋白,并制备了多克隆抗体。

关键词:隐花色素 融合蛋白 多克隆抗体

中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1003-9082(2018)01-0-02

光受体在植物的光形态建成中起重要作用,参与植物生长发育过程中一系列的生理生化及代谢反应[1]。隐花色素是在所有主要的演化谱系上基因表达光调节的蓝光受体,但是其信号转导的分子机制仍然还没被完全揭示。光经过这些受体进行信号转导,引起生理生化反应,抑制下胚轴伸长、调节开花时间、气孔开放、刺激子叶扩展、引导昼夜节律时钟和调节基因表达等[2],进而调节植物的生长发育,以更好适应外界环境。本研究克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2三个隐花色素基因末端400bp到600bp,构建基因高效表达载体,在大肠杆菌中诱导蛋白表达,纯化出融合蛋白,制备多克隆抗体,为后续隐花色素基因的利用和改造奠定基础。

一、材料与方法

1.材料

1.1菌种、质粒和培养基

大肠杆菌( Escherichia coli)BL21和DH5α、质粒pET29a(+) 均由本实验室保存。LB 培养基:10 g·L - 1蛋白胨, 5 g·L - 1 NaCl, 5 g·L - 1酵母粉,pH 7. 0; 120 ℃高压灭菌20 min, 4 ℃保存备用。

1.2酶、生化试剂及试剂盒

Taq TM DNA聚合酶、胶回收试剂盒( PCR Fragment Recovery Kit)及相关PCR引物购自上海生工生物工程有限公司,限制性内切酶和T4 连接酶购自大连TaKaRa公司 ;Kan(卡那霉素) 、Amp (氨苄青霉素)、PMSF(苯甲基磺酰氟)来自美国AMERSCO公司;琼脂糖(Biowest agarose) 、质粒提取试剂盒(MediBEST Plasmid Purification Kit )和Ni-NTA Superflow Cartridge购自Qiagen公司(上海) ;ECL检测试剂盒、 NC (硝酸纤维膜) 转印膜为GE 公司产品; IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)购自厦门星隆达化学试剂有限公司;弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂为北京鼎国公司产品;其余药品为国产分析纯生化试剂。

1.3实验动物

3只大耳成人家兔,体重约2 kg。

2.方法

2.1日本晴水稻基因组DNA的提取

用CTAB法[3]提取日本晴水稻基因组DNA。

2.2表达载体构建

以含有CRY1a、CRY1b、CRY2粳稻日本晴基因组DNA模板,Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物,PCR 扩增获得目的片段,回收产物经Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1双酶切后连入pET29a(+)表达载体,转入大肠杆菌DH5α,重组质粒鉴定后,送上海生工生物工程有限公司测序。引物序列如下:

Oscry1acctpET-Nde1: 5acta-CATATG-gactcct ccgacgtgcc gccgat 3

Oscry1acctpET-Xho1: 5acta-CTCGAG-GCCTTCTCTCCCAGTCCAGTTGCT 3

Oscry1bcctpET-Nde1: 5 Caac-CATATG-tcctcggag gttccaccaattg 3

Oscry1bcctpET-Eag1: 5Atta-CGGCCGa-CCAAACTGGGACTACGCCTC 3

Oscry2cctpET-Nde1: 5cgac-CATATGa-cagaatggat tcatcatcca tg 3

Oscry2cctpET-Xho1: 5 ctta-CTCGAG-TGCGGCTTTTCGTTGTCTTGA 3

2.3 融合蛋白的表达

将表达载体pET29a(+)-cry1a、pET29a(+)-cry1b、pET29a(+)-cry2转化大肠杆菌BL21表达菌株[4],在平板(50 μg/mL Kan+)上筛选,挑取单克隆菌落,培养至对数生长期,测其OD值为0.5,加入IPTG诱导。4℃,5000rpm,离心10分钟,收集菌体,弃上清。1 mL 菌液沉淀用100μL上样缓冲液 (50mmol/Ltris-HCL(pH6.8)、 100mmol/L 二硫苏糖醇、2%SDS (电泳级)0.1%溴酚蓝、10%甘油) 重悬,煮沸4分钟,离心后上清液,多克隆抗体在12%SDS-PAGE中分离检测[5] 。

2.4融合蛋白的亲和纯化收集

100 mL 诱导表达后的菌体,离心收集沉淀。每克大肠杆菌中加3mlNPI-10(50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑,pH8.0)或Buffer B(8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl,pH8.0)重悬沉淀,低温超声破碎。每克菌加入8ul 50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和8ul溶菌酶(10mg/ml),在4℃下20min内不时地进行搅拌。一边继续搅拌一边在每克大肠杆菌中加入4mg去氧胆酸[6]。放置悬浮液于37℃并用玻棒不时地搅拌。当裂解物变粘稠时,在每克大肠杆菌中加入20ul 核酸酶(1mg/ml),室温(25℃)贮藏直至裂解液不再粘稠。离心后,将上清载入Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱,用5倍柱体积NPI-20(50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑,pH8.0)或Buffer C(8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl,pH6.3)冲洗3-5遍,再用NPI-250(50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑,pH8.0)或Buffer E(8mol/L尿素、100mmol/L NaH2PO4、100mmol/L Tris·Cl,pH4.5)洗脱。最后收集洗脱组分,利用12%SDS-PAGE 进行分离检测。

2.5多克隆抗体的制备

将100?g抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用并加入1ml弗氏不完全佐劑溶液,剧烈震荡使之充分乳化,用5ml注射器抽取该乳化液,接上25G针头,排除注射器中的气泡。将兔子放在平坦处,在4个不同的部位进行皮下注射,两处在后背,两处在大腿处[7]。在4个不同部位分别各注射约500?l抗原溶液。4-6周后再次注射抗原,并在注射后的7天-10天,每只兔子耳缘静脉取血0.5~1 mL,分离抗血清。[8]

二、结果与分析

1.三个CRY基因PCR扩增

以日本晴基因组DNA为模板, Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物进行PCR扩增,产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带,且大小与预测基因一致,用胶回收试剂盒回收目标条带。

2.三个CRY基因表达载体的构建

质粒pET-29a(+)和目的片段酶切连接后,转化大肠杆菌DH5α。挑选单克隆进行振荡培养后,分别以Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物进行PCR扩增,筛选正确的克隆子。提取PCR检测阳性的克隆子重组质粒,以Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1进行双酶切验证(图1)。结果显示,三个重组质粒的双酶切产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测均有双条带,且大小与预期结果一致。重组质粒上海生工生物工程有限公司测序,测序结果与已报道序列一致。

3.重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

三个重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌培养至细胞密度(OD600)为0.5-0.6,加入终浓度为0.7 mmol·L - 1 IPTG进行诱导培养3-4小时。诱导后的细菌细胞煮沸后12% SDS-PAGE电泳,显示如图2。诱导后融合蛋白大小均在20-30KD,连接6个His标签。

4.融合蛋白的分离纯化

利用Qiagen公司的Ni-NTA Sp in Column进行三个CRY融合蛋白的分离纯化。用pH 7. 4的0. 05 mol·L - 1磷酸盐缓冲液(含0 - 0. 5 mol·L - 1咪唑)的进行梯度洗脱[9],收集纯化的重组CRY蛋白,经SDS-PAGE检测 (图3)。纯化蛋白条带单一,其纯度高,可用于多克隆抗体的制备。

5.多克隆抗体特异性分析

将制备的多克隆抗体稀释7500倍,以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白为抗原(100ng)进行包被,三种多克隆抗体分别作为一抗,ELISA检测显示三种多克隆抗体分别有反应,且有交叉反应。以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白作为抗原(100ng),用三种多克隆抗体(1:500,1:2000,1:2000)进行点杂交,发现融合蛋白只与对应多克隆抗体有反应,证明由此方法得出结果的多克隆抗体特异。

三、结论

本研究构建了pET-29a(+)-OsCRY1a、pET-29a(+)-OsCRY1b、pET-29a(+)-OsCRY2三个高效表达载体,并在大肠杆菌中His诱导融合蛋白表达,分别获得大约20-30kD的CRY融合蛋白,并利用His标签纯化出特异的融合蛋白,免疫家兔后可获得较为特异的多克隆抗体。本研究为隐花色素转基因水稻的功能验证奠定基础,以期进一步深入了解水稻隐花色素基因各自的功能。

参考文献

[1]李毓,庄春红,庄伟建,等. OsCRY2基因抑制表达对水稻主要农艺性状的影响[J].核农学报.2011,25(6):1094-1099.

[2]李毓,庄伟建,庄春红,等.干扰隐花色素Cry1a与Cry1b基因的表达对水稻若干农艺性状的影响[J].福建农林大学学报(自然科学版).2012,41(2) : 153-158.

[3]王关林,方宏筠主编.植物基因工程(第二版),2002年8月.北京:科学出版社.742-746.

[4]李立芹.烟草WRKY12基因的分离、表达与多克隆抗体的制备 [J].核农学报,2011,25(3):461-468.

[5]陈建飞,金先庆,丁雄辉,等.新耐药基因HA117多克隆抗体的制备与鉴定 [J].第三军医大学学报,2011,33(11):1128-1131.

[6]单丽伟,唐如春,刘三阳,等.小麦种子过氧化物酶 WP1 基因的原核表达、 纯化及多克隆抗体制备 [J].生物工程学报,2011,27(1):26-30

[7]CYP3A22 重组腺病毒载体构建与表达 [J].医药卫生,2016,05(29): 284-284.

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[9]俞俞,邢卫锋,周茜,等. 拟南芥转录因子DYT1的原核表达与多克隆抗体制备 [J].西北植物学报,2011,31(2):0261-0266.

作者简介:庄春红,福建惠安,汉族,1988年2月出生,微生物学硕士研究生,主要研究方向微生物方向。