应用微卫星标记对两个SD大鼠封闭群的遗传分析

洪 杨, 袁明铭, 周 静, 张 磊, 董 涵

(四川省中医药科学院, 成都 610041)

SD大鼠是常用的封闭群实验大鼠，在科研、检定和教学等领域被广泛使用。作为封闭群动物，是以非近亲交配方式繁殖，具有个体遗传多态性和群体遗传一致性的特点。遗传多态性是指群体基因型的多态性，个体间的杂合性。遗传一致性则指整个封闭群动物的基因频率保持稳定[1]，在封闭群动物繁育过程中，要尽量保证动物随机交配并减少破坏遗传平衡的因素，从而使不同地区同一品种的动物遗传上保持一致。封闭群实验动物的遗传多态性和遗传一致性是保证实验结果可靠性和一致性的重要条件。目前，全国各地SD大鼠各自封闭繁育，长此以往可能导致群体间的遗传分离，因此，有必要定期对SD大鼠进行遗传监测。

对封闭群动物，目前还缺乏统一的遗传检测标准和方法。通常遗传质量检测是依靠遗传标记物来进行。传统遗传标记物有形态标记、细胞标记和生化标记。传统遗传标记物主要是对基因表型的标记，不能反映遗传本质的差异和变化，且存在数量少、多态性不丰富等缺点，因此其应用范围受到很大限制[2]。随着分子生物学的发展，越来越多学者利用分子标记进行遗传质量检测，该方法能直观地反映生物遗传本质的变化。常用的分子遗传标记包括限制性片段长度多态性、微卫星DNA、单核苷酸多态性等，其中微卫星DNA应用广泛[2]。微卫星DNA又称简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)或短串联重复序列(short tandem repeats,STR)，是以少数几个核苷酸为单位、多次串联重复的DNA序列，具有分布广、数量大、保守性强、多态信息含量高等特点[3]，被认为是遗传相关研究的最主要分子标记之一。本试验利用微卫星标记技术检测北京和上海两个单位SD大鼠封闭群的遗传多样性并分析两群体间的遗传关系，以期获得这两个SD大鼠封闭群的遗传概貌信息，并从分子遗传角度对其现有繁育方式作出评价，同时为SD大鼠遗传检测方法和标准的建立提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购自北京[SCXK(京)2012-0001]和上海 [SCXK(沪)2012-0002] 两个单位6周龄SPF级SD大鼠各30只，雌雄各半，体质量150～160 g。大鼠经脱颈法处死后取肝脏组织，-20 ℃保存备用。所有动物实验均按照实验动物使用的“3R”原则，对实验动物给予人道关怀。本研究所有实验均在四川省中医药科学院实验动物中心屏障设施内进行[SYXK(川)2013-100]。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒, 为天根生化科技(北京)有限公司产品; Prime STAR HS (Premix), 购自日本Takara公司; Separation Buffer、Size Marker、Alignment Marker均由美国Bioptic公司提供。

1.3 引物选择

选择多态性好的7个微卫星位点(R43、R63、R88、R103、R132、R142、R159)进行试验[4]，各微卫星位点详情见表1。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表 1 7个微卫星位点引物序列Table 1 Primer sequences of 7 microsatellite loci

1.4 方法

1.4.1 基因组DNA提取 取大鼠新鲜肝脏组织50 mg,利用组织匀浆机进行匀浆，以DNA提取试剂盒进行组织DNA提取，利用超微量分光光度计检测DNA浓度，将符合PCR模板浓度要求的基因组置于-80 ℃保存备用。

1.4.2 PCR扩增 PCR反应体系为25 μL, 2×Prime STAR HS (Premix) 12.5 μL; 上游引物(1 μmol/L)2.5 μL; 下游引物 (1 μmol/L) 2.5 μL; 模板(500 ng/μL)1.0 μL; ddH2O 6.5 μL。PCR 反应条件: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性 1 min, 退火 1 min, 72 ℃延伸 30 s，35个循环后，72 ℃延伸3 min。利用Qsep100全自动核酸分析系统对PCR产物进行分析。

1.5 数据统计分析

利用Q-Analyzer软件读取等位基因片段大小，通过PopGene1.32软件计算观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、群内近交系数(Fis)、遗传分化系数(Fst)、Nei无偏遗传距离、Hardy-Weinberg平衡(HWE)等指标。PIC_CALC软件对每个位点进行多态信息含量(PIC)分析。

2 结果

2.1 各微卫星位点在总群体上遗传变异

等位基因频率分析结果如表2所示。SD大鼠总群体的Na、Ne、Ho、He和PIC结果见表3。

所检测的7个微卫星位点，每个位点的等位基因数为4～8个。在两个SD大鼠群体共有等位基因39个，北京某单位SD大鼠34个，上海某单位SD大鼠36个，有31个等位基因同时在两个单位SD大鼠中存在，前者SD大鼠特有等位基因3个，后者为5个。从表中结果可以看出，所检测的7个微卫星位点均具有较好的遗传多态性。

表 2 两个封闭群SD大鼠7个微卫星位点基因频率分布Table 2 Allele frequencies of 7 microsatellite loci in two closed colonies of SD rats

2.2 两个SD大鼠群体遗传多样性与遗传结构

分别统计两个大鼠群体的Na、Ne、Ho、He和PIC(表4)。从表中数据可看出，两地区SD大鼠群体的等位基因数差异较小，两个封闭群体均具有丰富的遗传多样性。

两大鼠群体的HWE检验结果和Fis见表4。结果表明两封闭群体内均存在一定程度的近交。

2.3 两SD大鼠群体间的遗传关系

两SD大鼠群体间Fst (表3)范围从0.005 1到0.220 3，平均为0.0821，表明中等程度的遗传分化。Nei (1978)无偏遗传相似度和遗传距离分别为0.8537和0.1582。

表 3 7个微卫星位点在总群体中的遗传变异Table 3 Genetic diversities of 7 microsatellite loci across colonies

表 4 7个微卫星位点在两个SD大鼠群体中的遗传信息Table 4 The genetic information of 7 microsatellite loci in two colonies of SD rats

3 讨论

3.1 所选微卫星位点在SD大鼠群体遗传检测中的适用性

对封闭群实验动物进行遗传分析，可掌握群体的遗传概貌，为封闭群动物的生产繁育提供理论依据。本文用微卫星标记技术检测了北京和上海两个单位SD大鼠群体的遗传状况。由于微卫星位点数量多、各位点之间多样性差异较大，因此，不是每个微卫星位点都适合用来进行遗传检测。对封闭群动物而言，需要选择遗传多样性丰富的位点。PIC是基因丰富度的衡量指标，PIC＞0.5为高度多态，表示该遗传标记具有高度的可提供遗传信息性; 0.25＜PIC＜0.5为中度多态; PIC＜0.25为低度多态，该遗传标记可提供的遗传信息较差[5]。本文所检测的7个位点在两个SD大鼠群体中的PIC范围在0.292 9～0.809 9(表3), 平均值为0.670 9, 其中只有位点R159的PIC为0.292 9，为中度多态，其余6个位点PIC均大于0.5，为高度多态，高度多态位点占比85.7%。表明本文所选择的微卫星位点所提供的多态信息含量丰富，能作为有效的遗传标记用于SD大鼠群体的遗传分析。

本文中两大鼠群体在7个微卫星位点上的Na为39个, 每个位点为4～8个, Ne除位点R159为1.445 5外, 其余6个位点范围从3.153 7到5.901 6，而传统的表型检测，每个位点只能检测出2～3个等位基因[6]，因此，相比传统遗传检测方法，微卫星标记技术更能真实反映封闭群实验动物的遗传概貌。

3.2 北京和上海两个SD大鼠群体的遗传多样性与遗传结构分析

封闭群动物遗传学特点主要体现为个体间具有较大遗传变异和群体的遗传特性保持稳定。遗传变异大小体现在个体杂合性大小, 而遗传特性保持稳定则是保持群体基因频率的稳定[7]。杂合度(H)和PIC常被用来评价封闭群个体杂合性高低[8]。H是指群体某位点上杂合子的频率, 理想的封闭群体H应介于0.5～0.7[9]。较高的突变率可使PIC值较高[10], 因此, H和PIC数值越高说明群体遗传变异越大。本文中北京某单位SD大鼠的Ho和He为0.647 6、0.692 1, 上海为Ho和He为0.585 7、0.713 3, 两个群体的杂合度都比较高。北京和上海的SD大鼠在7个微卫星位点上的平均PIC分别为0.644 5和0.667 6, 均属于高度多态, 说明两个群体均具有较高的遗传多样性。

HWE检验用于衡量群体内等位基因频率是否处于稳定，当HWE检验P＞0.05时，表示群体在该位点处于平衡状态，反之，则偏离HWE[8]。本文中北京某单位SD大鼠有3个位点偏离HWE，上海某单位SD大鼠有2个位点偏离平衡状态，两个种群在其余位点上P(HWE)值＞0.05, 均符合HWE，说明群体结构比较稳定。对于偏离HWE的位点，可能反映了在繁殖过程中未能实现完全的随机交配，以致存在一定程度的近交。群内近交系数Fis是种群内个体间的近交系数, 其取值范围为-1～1，当Fis值为正时，表示群体内有近交现象[11]。北京和上海的SD大鼠均有2个位点的Fis值为正，并且两个SD大鼠种群的He均高于Ho，表明两个群体中存在部分纯合子个体。结合2个位点的Fis＞0，He＞Ho，说明本研究所检测的北京和上海SD大鼠封闭群内存在近交现象[12]。目前，由于对封闭群实验动物缺乏遗传监测，无法对繁育方式和繁育效果进行有效的评估。因此，要保证封闭群实验动物的遗传质量，除在繁育环节要严格遵守相应的操作程序外，还应定期进行遗传检测，从而对繁育效果作出评估，对繁育方式作出及时调整。

3.3 北京和上海两个SD大鼠群体的遗传关系

长期以来，全国各地SD大鼠均处于各自封闭培养的状态，是否已经出现群体间的遗传与表型的分离还未可知。对于本文中的两个SD大鼠群体间的遗传关系，可从以下几点进行评估。首先，从等位基因组成上看，两个种群共有基因数为31, 占总等位基因数的79.5%，表明两个种群间有一定的遗传差异。遗传分化指数Fst是目前应用最广泛的衡量群体间遗传分化程度的指标。当Fst＜0.05时,说明群体间遗传分化较弱; 当 0.05＜Fst＜0.15 时, 群体间遗传分化程度中等; 当 0.15＜Fst＜0.25 时, 表示群体间遗传分化较大，Fst＞0.25时，群体间遗传分化极大[13]。 本文所检测的两个群体在7个微卫星位点上, 有4个位点Fst＜0.05, 2个位点为0.05＜Fst＜0.15, 1 个位点为 0.15＜Fst＜0.25, 平均值为 0.082 1,即两个种群间遗传分化程度中等。遗传距离是表示群体间遗传分化或遗传差异的重要参数，本文中两SD大鼠群体间的Nei (1978)无偏遗传距离为0.158 2,同样表明群体之间中等程度的遗传差异。

目前，针对封闭群实验动物国内外还未确立公认的遗传检测方法和标准。因此，除了长期的遗传隔离使不同地区的SD大鼠封闭群产生遗传分化外，缺乏有效遗传监测也是重要原因之一。本研究结果表明，筛选的微卫星标记或可作为对SD大鼠封闭群进行遗传检测的有效手段。

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