封闭群树鼩的微卫星遗传特性分析

刘城秀, 李 娜, 仝品芬, 王文广, 陆彩霞, 罕园园, 匡德宣, 孙晓梅, 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室, 昆明 650118)

树鼩(Tupaia belangeri)是一种外形类似松鼠的小型哺乳动物，隶属于攀鼩目。包括树鼩全基因组序列分析[1]在内的核DNA序列, 以及综合不同的DNA数据研究结果，证实树鼩为灵长类的近亲[2]。与灵长类动物比较，树鼩具有体型小、生殖周期短、饲养成本低、脑-体质量比例高等优点，树鼩被广泛应用于多种人类疾病的动物模型研究，如病毒感染[3]、生理解剖[4]、心理应激[5]和视觉系统疾病[6]等方面的研究。树鼩作为实验动物新品种，需有相对稳定的遗传特征，封闭群状态和随机交配的群体基因频率要基本保持稳定不变。定期进行树鼩的遗传多样性监测，可以保证动物群体的基因杂合性, 避免因近交造成的遗传衰退, 利用其开展实验研究可以提高实验结果的重复性和稳定性。已有报道指出树鼩具有较高的遗传多样性，Chen等[7]通过分析昆明周边野生中缅树鼩线粒体DNA(mtDNA)控制区序列片段之间的核苷酸差异，发现树鼩群体内存在个体遗传差异。微卫星(Microsatellite)是在基因组中的短串联重复序列(short tandem repeats, STR)可作为第二代遗传检测技术，因具有高度多态性、供个体识别的标记位点、能够反映出动物的遗传变异情况且操作简便，可作为实验动物遗传质量的检测方法[8], 现已成为国内外研究遗传多样性的有效可靠手段[9]。我们自2006年以来, 引进野生滇西亚种树鼩(Tupaia belangeri chinensis), 以随机交配方式,开展封闭群树鼩种群的培育, 前期研究黎家敏等[10]应用RAPD标记技术对该种群进行分析，发现该树鼩种群有丰富的遗传多样性，张媛等[11]筛选的22个微卫星位点适用于滇西亚种树鼩的遗传检测。本研究利用微卫星位点评估该树鼩群体的遗传多态性，对每个代次的树鼩进行遗传质量检测，验证该树鼩群体是否维持其遗传稳定性，为推动树鼩优良品系的培育和人类疾病树鼩模型的创建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

PCR反应扩增仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公司); 3730XL测序列分析仪(美国 ABI公司) 。DNA提取试剂盒DNeasy Blood& Tissue Kit(德国 Qiangen公司); Ex Taq聚合酶、6×DNA Loading Buffer、DL500 Marker (中国大连TaKaRa Biotech公司); HIDI、LIZ500(美国 ABI公司)。

1.2 动物及样品来源

医学生物学研究所树鼩种质中心野生P0代滇西亚种树鼩引自云南禄丰县共200只, 其中雄性82只,雌性118只, 随机采集其远交繁殖的I～IV代滇西亚种树鼩共49只, 雌性31只, 雄性18只，其中Ⅰ代17 只, Ⅱ代16 只, Ⅲ代12 只, Ⅳ代4 只[SCXK(滇)K2013-0001][SYXK(滇)K2013-0001]。对树鼩进行尾静脉采血0.2～0.3 mL，EDTA抗凝，提取基因组DNA，具体操作参考DNA提取试剂盒的说明书。用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA条带是否完整, 并检测其纯度和浓度, A260/A280比值应为1.7～1.9, 将DNA浓度稀释到20～30 ng/μL,于-20℃保存备用。

1.3 选择微卫星位点和设计筛选引物

参照文献[11-14]选择18个微卫星位点进行遗传多样性分析，所有引物由生物公司合成并进行荧光染料标记(FAM 蓝)。各微卫星位点引物序列相关信息见表1。

1.4 PCR扩增和产物检测

PCR反应总体系15 μL: Ex Taq 0.1 μL, 10×Ex Taq Buffer1.5 μL, dNTP Mixture 1.2 μL, 上、下游引物(10 mmol/L)各为 0.2 μL，DNA 模板(20 ng/μL)1 μL，加ddH2O至反应终体积为15 μL。

PCR扩增条件: 98 ℃预变性3 min，98 ℃变性 10 s，51～57 ℃退火 30 s，30 个循环，72 ℃延伸1 min，72℃最终延伸3 min。取3 μL PCR扩增产物，质量分数2%琼脂糖凝胶电泳。

1.5 毛细管电泳检测扩增片段

取PCR产物1 μL，GS-500 Liz分子量内标与Hi-Di甲酰胺按比例配置，取9 μL，与PCR产物混匀, 96 ℃变性5 min，然后在3730XL自动测序仪上进行毛细管电泳检测(本部分由生物公司进行完成)。由Genemarker2.0软件自动生成各位点在每个样品上的图谱文件, 根据峰值图获取产物片段大小。

1.6 数据统计与分析方法

使用CONVERT(version 1.31)软件[15]转化数据格式，利用POPGENE(version 1.32)软件进行遗传多样性分析，包括计算群体的基因型频率、多态位点百分率(percent of polymorphic loci，PPL)、等位基因数(the number of alleles, Na)、有效等位基因数(effective number of allele, Ne)、观察杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity, He)、Nei遗传多样度(H)、Shannon信息指数(I)等指标, F-统计量(Fis, Fit, Fst)种群间和种群内的分子遗传变异分布情况和基因流(gene flow,Nm)。用 Nei’s的遗传一致度(genetic identity)和遗传距离(genetic distance)来衡量各种群之间的遗传分化大小。利用FSTAT(version 2.9.3)软件计算各位点的等位基因丰富度(allele richness, AR)。多态信息含量(polymorphism information content, PIC)使用PIC-CALC 软件计算。运用GENEPOP(version 4.2)软件[16,17]检验各种群等位基因频率是否偏离哈温平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。使用SPSS(version 16.0)软件中的多个样本均数比较的方差分析以及独立样本t检验进行数据统计分析, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 毛细管电泳检测结果

2个树鼩样品在TBC19位点上的检测结果表明该微卫星位点DNA产物片段大小(基因型)分别为202 bp(纯合子)和 202 bp /208 bp(杂合子)(图 1、图 2)。

2.2 四个代次的树鼩群体的遗传多样性

对I～IV代树鼩群体多个样本均数比较的方差分析结果表明差异均无显著性(PNe=0.496、PHe=0.990、PI=0.426、PPIC=0.654、PAR=0.987), 不同代次群体内的遗传多样性水平较高, 各群体中Ho均小于He, 说明群体内可能存在杂合子缺失现象。从PPL的结果可以看出群体I、II、III代的多态性百分比均为100%多态性较好; Ⅳ代树群中, TB1位点无多态性, 其群体的多态性百分比为94.44%, 多态性最差。Ⅳ代树鼩Na、Ne、I、He、H 和PPL指标中均为最小, 说明其遗传多样性较低(表2)。

对四个代次的树鼩18个微卫星位点进行HWE检测(PHW)结果显示，TBC16在I代树鼩、TBC30在Ⅱ代树鼩、TBC20在Ⅲ代树鼩表现为极显著偏离HWE(P＜0.01); TBC18在I、III代树鼩、TBC20在I代树鼩、TBC21在I、Ⅳ代树鼩、TBC26在I、II代树鼩、TBC30在I代树鼩、TB6在III代树鼩都处于显著偏离平衡状态(P＜0.05); 其他位点在其他的代次树鼩群体中处于平衡状态(P＞0.05)。

表 1 树鼩18个微卫星位点的相关信息及退火温度Table 1 Information and annealing temperature on 18 microsatellite loci from tree shrews

2.3 各微卫星位点遗传变异

四个代次树鼩群体在18个微卫星位点共检测到89个等位基因。每个代次进行独立样本t检验，结果提示差异均无显著性(PI=0.111，PII=0.070，PIII=0.064，PIV=0.184), 表明各等位基因在树鼩的遗传多样性分析中具有有效性。当把四个代次的群体视为整体，群体观察杂合度和期望杂合度间差异不显著(PI=0.137, PII=0.525, PIII=0.384, PIV=0.173);遗传多样度H的结果显示，各个位点(除TB1)的多态性水平较高(表3)。

图 1 微卫星位点TBC19的扫描结果(202 bp/202 bp)Figure 1 The result of genotypic alleles TBC19 locus (202 bp/202 bp)

图 2 微卫星位点TBC19位点扩增的扫描结果 (202 bp/208 bp)Figure 2 The result of genotypic alleles TBC19 locus (202 bp/208 bp)

表 2 四个代次树鼩群体18个微卫星位点的遗传多态性及Hardy-Weinberg平衡检验Table 2 Genetic diversities and Hardy-Weinberg equilibrium test of 18 microsatellite loci in the four tree shrews colony

续表 2

续表 2

表 3 树鼩群体18个微卫星位点的遗传特征Table 3 Genetic characteristics of 18 microsatellite loci used in tree shrews colony

2.4 树鼩群体遗传结构

F-统计量和基因流的分析结果如(表3)所示, Fis有6个位点为负值, 其余位点均为正值，正值范围0.007～0.639; 同样, Fit也有 6 个位点为负值, 其余位点均为正值, 正值范围0.066～0.646。根据Fis和Fit平均值的统计结果, 群体间近交程度较高, 群体内个体间的遗传近交程度较低。Fst范围为0.010～0.143,平均值为0.046, 表明不同代次树鼩群体间的遗传分化水平较低。而树鼩群体基因流Nm值为1.503～24.716,平均值为5.240＞1, 表明该群体间的基因交流相对较高, 不同代次内遗传分化不大, 基因结构稳定。

2.5 树鼩群体遗传同一性和遗传距离

通过Popgene 1.32软件计算出I～IV代树鼩的Nei(1972)遗传同一性和遗传距离, 以及Nei(1978)无偏遗传同一性和遗传距离(表4和表5), 其同一性的范围分别为0.853～0.952(平均为0.915)和 0.897～0.979(平均为0.951); 遗传距离的范围分别为 0.049～0.159(平均为0.089)和0.022～0.109(平均为0.051), 其差异并不大, 结果表明遗传同一性较好, 遗传背景相似。

3 讨论

平均Na为遗传多样性度量指标，Ne是反映群体遗传变异程度的一个重要指标，如果Ne与Na越接近，则说明该等位基因在群体内分布的均匀度就越好。本研究所用的18个微卫星位点中，TBC21的Ne和Na最接近(0.814)，而TBC23的Ne和Na相差最大(6.884), 说明该位点等位基因的分布较其他位点均匀度差，可能是育种过程中人工选择因素所导致的。以TG4位点为例，Srikwan等[12]以普通树鼩为研究群体，所得到的Na为6; 而Su等[18]对广西瑶山亚种树鼩为研究对象，该位点并没有多态性; 本研究所得到的Na为4，因此可以推测出不同地区的不同亚种树鼩在某些位点上的差异比较大。

表 4 I～IV四代的遗传同一性和遗传距离Table 4 Nei's original measures of genetic identity and genetic distance

表 5 I～IV四代的无偏遗传同一性和遗传距离Table 5 Nei's unbiased measures of genetic identity and genetic distance

杂合度是群体内遗传变异的量度，其值的高低反映了群体内个体的均匀度，若数值高，表明群体内的遗传变异大，数值低，则表明群体内的遗传变异小，主要包括Ho和He。Ho是指杂合个体在群体中的比例，在Na相同的情况下，杂合基因型的个体在群体中的比例越高，则说明该群体遗传多样性越丰富。He是假定各基因座位符合HWE的前提下算得的杂合度; 在一个群体中，如果没有对样本中杂合个体的比例进行实际测量，可以通过等位基因频率间接去计算出该群体预期的杂合度大小。另外，平均He[19]可以衡量群体内遗传变异，度量群体的遗传多样性，是群体遗传结构分析的最直接和最有效的方法，该指标不易受到样本取样的影响，其大小近似反映群体遗传结构的变异程度。平均He期越高, 反映群体的遗传一致性就越低, 其遗传多样性就越丰富, 反之, 说明群体的遗传一致性越高。当一个群体的平均He低于0.5时, 其遗传多样性就偏低, 该群体有近亲繁殖的背景, 近交系数就偏高, 该群体已不符合封闭群动物特征。而当一个群体的平均He高于0.7时, 其遗传杂合度就偏高, 该群体的个体差异就很大, 该群体也不符合封闭群动物特征[20]。本研究I～IV四个代次的树鼩其平均He分别为0.623、0.607、0.603和0.600, 均在0.5～0.7的范围内, 符合封闭群动物的特征。整个群体的平均He为0.613, 低于Munshi-South等[14]利用微卫星位点对细尾树鼩群体的研究(0.74)、唐艳萍等[21]对广西和云南树鼩群体遗传多样性的比较(0.703)、杨香娣等[22]对广西树鼩种群的多态性研究(0.6963), 高于Su等[18]对广西瑶山亚种树鼩遗传多态性的研究(0.480), 推测出现这种差异的原因可能与所采用的树鼩亚种、选择的微卫星位点以及检测手段不同有关; 与Liu等[13]对滇西亚种树鼩遗传多态性的研究(0.616)、杨芳等[23]对滇西亚种树鼩遗传多态性的研究(0.615)结果较一致。对比不同的实验结果, 我们可以推测出不同地理位置、不同亚种的树鼩存在个体遗传差异。进一步与张媛等[24]对该实验室的野生P0代30只树鼩所做的遗传多样性的研究结果相似(0.613 8)，并且本研究I～IV代树鼩平均I分别为1.242、1.182、1.149和0.936, 总群体平均I为1.277,也与本实验室之前的研究结果相似(1.265), I是度量一个随机交配群体中所受选择、突变和遗传漂变的综合影响, 其值越大, 说明混乱程度越高, 反之亦然[25], 这些数据都表明本实验室的实验动物群体内遗传变异不大, 遗传稳定。

PIC为衡量遗传标记多态性的指标，描述位点的变异程度，是反映群体内个体遗传变异程度的重要参数，其值越大说明遗传变异越高，反之越低。Botstein等[19]提出衡量基因变异程度高低的PIC的指标: 当PIC＞0.5时，为高度多态性: 当PIC为0.25～0.5时，为中度多态性; 当PIC＜0.25时，则为低度多态性。本研究结果显示I～III代树鼩平均PIC分别为0.556、0.536和0.526，提示这三个树鼩群体的遗传多态性均较高，而Ⅳ代树鼩平均PIC为0.468为中度多态性，造成这种现象的原因可能是本研究中Ⅳ代动物样本量在不同代次样本中比例偏低，应在进一步实验中扩大样本量。

本研究的遗传多态性比较显示, 除II代平均Ho最高, 其余III、I、IV代依次降低外, 平均Ne、He、PIC、I值都是I、II、III、IV代依次减低, 但差异不显著, 表明该树鼩群体都呈现出较丰富的遗传多样性, 表现出比较好的资源种质状况, 具有进一步选育的价值和潜力。同时, 在分析数据中可以看出, 由于TB1位点而影响各参考指标(Na、Ho、He、I、PIC、AR)平均值偏低, Liu[13]等利用TB6位点对117只中缅树鼩遗传多态性的研究结果显示, 在该群体Na、Ne、Ho、He、PIC分别为4、1.193、0.103、0.107和0.12, 与本研究所得的结果差别不大。

理想情况下, 封闭群动物处于遗传平衡状态, 本实验四个代次树鼩群体18个位点的HWE检测显示大部分位点P＞0.05, 总体水平符合HWE, 表明该封闭群树鼩遗传结构具有遗传稳定性和均一性。此外, 遗传分化系数(Fst)是反映的群体间遗传分化程度的重要指标, Fst值介于0～0.05, 说明种群间分化很弱, 本研究群体的Fst均值为0.046(＜0.05), 说明四个代次树鼩群体间遗传分化水平很低。这些结果表明该封闭群树鼩遗传质量稳定，符合封闭群动物的遗传特性。遗传距离是衡量群体间、系统间遗传分化程度和遗传差异大小的主要指标。群体遗传距离与分化时间成正比, 如果群体间的分化时间越长, 遗传距离也就越大, 反之亦然。黎家敏[10]等通过对48只云南滇西亚种树鼩进行随机扩增多态性DNA标记法(RAPD)研究其个体间遗传多样性, 得到的个体间遗传距离在0.09～0.27, 平均遗传距离为0.169 3, 表明滇西亚种树鼩的个体之间差异很大。本研究中该树鼩群体的Nei(1972)遗传距离及Nei(1978)无偏遗传距离分别为0.049～0.159和0.022～0.109, 与其研究结果比较,表明该群体间不存在较大的遗传差异和分化程度。

综上所述，本研究结果表明四个代次的树鼩的遗传多样性都较丰富，该群体间不存在较大的遗传差异和分化程度。这些数据为推动树鼩优良品系的培育和实验动物模型的创建奠定了基础。

[1] Fan Y, Huang ZY, Cao CC, et al. Genome of the Chinese tree shrew [J]. Nat Commun, 2013, 4:1426.

[2] 许凌, 范宇, 蒋学龙, 等. 树鼩进化分类地位的分子证据[J].动物学研究, 2013, 34(2):70-76.

[3] Yu W, Yang C, Bi Y, et al. Characterization of hepatitis E virus infection in tree shrew (Tupaia belangeri chinensis) [J]. BMC Infect Dis, 2016, 16:80.

[4] Lu JS, Yue F, Liu X, et al. Characterization of the anterior cingulate cortex in adult tree shrew [J]. Mol Pain, 2016, 12:1-11.

[5] Pryce CR, Fuchs E. Chronic psychosocial stressors in adulthood: Studies in mice, rats and tree shrews [J]. Neurobiol Stress, 2017, 6:94-103.

[6] Gawne TJ, Siegwart JT, Ward AH, et al. The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews[J]. Exp Eye Res, 2017, 155:75-84.

[7] Chen SY, Xu L, Lu LB, et al. Genetic diversity and matrilineal structure in Chinese tree shrews inhabiting Kunming, China[J]. Dongwuxue Yanjiu, 2011, 32(1):17-23.

[8] Souza CA, Paiva SR, Mcmanus CM, et al. Genetic diversity and assessment of 23 microsatellite markers for parentage testing of Santa Ines hair sheep in Brazil [J]. Genet Mol Res,2012, 11(2):1217-1229.

[9] Nachtigall M, Bulow L, Schubert J, et al. Development of SSR markers for the genus Patellifolia (Chenopodiaceae) [J]. Appl Plant Sci, 2016, 4(8). pii: apps.1600040.

[10] 黎家敏, 李海燕, 李婧潇, 等. 应用RAPD标记技术对树鼩遗传多样性的分析[J]. 中国比较医学杂志, 2010, 20(2):34-40.

[11] 张媛, 李晓飞, 李振宇, 等. 滇西亚种树鼩微卫星分子标记的筛选[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(6):36-41.

[12] Srikwan S, Hufford K, Eggert L, et al. Variable microsatellite markers for genotyping tree shrews, tupaia, and their potential use in genetic studies of gragmented populations [J].Science Asia, 2002, 28(28):93-97.

[13] Liu XH, Yao YG. Characterization of 12 polymorphic microsatellite markers in the Chinese tree shrew (Tupaia belangeri chinensis) [J]. Dongwuxue Yanjiu, 2013, 34(E2):E62-68.

[14] Munshi-South J, Wilkinson GS. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in Bornean tree shrews(Tupaia spp.) [J]. Molecular Ecology Notes, 2006, 6(3):698-699.

[15] Glaubitz JC. convert: A user-friendly program to reformat diploid genotypic data for commonly used population genetic software packages [J]. Mol Ecol Resour , 2004, 4(2):309-310.

[16] Raymond M, Rousset F. GENEPOP (version1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism[J]. J Heredity, 1995, 86(3):248-249.

[17] Rousset F. DENEPOP'007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux [J]. Mol Ecol Resour , 2008, 8(1):103-106.

[18] Su AL, Lan XW, Huang MB, et al. Microsatellite analysis of genetic diversity in the Tupaia belangeri yaoshanensis [J].Biomedical Reports, 2017, 7(4):349-352.

[19] Botstein D, White RL, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms [J]. Am J Hum Genet, 1980, 32(3):314-331.

[20] 李薇, 江其辉, 杜小燕, 等. 封闭群长爪沙鼠遗传标准的建立[J]. 实验动物科学, 2011, 28(2):31-36.

[21] 唐艳萍, 曹骥, 杨香娣, 等. 广西和云南树鼩群体遗传多样性的比较分析[J]. 中国实验动物学报, 2016, 24(6):572-578.

[22] 杨香娣,曹骥, 杨春, 等. 荧光标记微卫星分析广西树鼩群体的遗传多态性[J]. 中国畜牧兽医, 2016, 43(1):182-190.

[23] 杨芳, 何保丽, 何永蜀, 等. 树鼩5个生化位点与11个微卫星标记位点的初步研究[J]. 昆明医学院学报, 2010, 31(5):8-11+16.

[24] 张媛. 滇西亚种树鼩微卫星筛选及群体多态性分析[D].北京: 北京协和医学院, 2015.

[25] 王琳琳, 徐金会, 秦桢, 等. 三个微卫星标记在喜马拉雅旱獭种群中的遗传多态性[J]. 曲阜师范大学学报: 自然科学版, 2008, 34(4):101-104.