NMDA受体磷酸化调控及其与神经系统疾病关系的研究进展

刘佩强，覃丹雪，陈慧英，黄喜，叶文华，苏纪平

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体是一种离子型谷氨酸受体，它在中枢神经系统兴奋性神经传递中发挥重要作用。NMDA受体的磷酸化调控是突触定位和功能调节的重要分子机制，其调节失调与缺血缺氧损伤、疼痛传导及老年性痴呆等神经退行性疾病等都有密切关系。本文总结了NMDA受体磷酸化研究的最新进展，并综述NMDA受体磷酸化与神经系统疾病的关系。

1 NMDA受体及磷酸化调控

突触传递是神经系统处理和储存信息能力的核心，哺乳动物大脑中的兴奋性突触传递主要由谷氨酸调节，而NMDA受体是主要的谷氨酸受体，其介导的Ca2+内流是突触可塑性的触发器，激活信号转导的级联反应，从而调节长时程增强和神经细胞变性。NMDA受体是由7种不同的亚单位NR1、NR2A～D和NR3A～B形成的四聚体，大多数NMDA受体由2个NR1和2个NR2亚单位装配而成，装配完成后的NMDA受体能选择性定位于兴奋性突触的突触后膜，调节突触的形成、修饰和删除等各种不同的功能。NMDA受体包含胞外配体结合域，胞外N端结构域，由3个氨基酸疏水性螺旋M1、M3、M4组成跨膜区域，胞内凹陷回路，胞内C末端[1]。

NMDA受体亚单位的C末端可调控受体装配运输和表面表达，基因敲除NR2A中CTDs表达的小鼠可以存活到成年期，但它们具有突触可塑性缺陷，而那些敲除NR2B中CTDs的小鼠则会死亡。受体调控失调可能是由于失去了磷酸化位点，细胞内蛋白的相互作用缺陷，或结构需求的变化导致的[2]。另有研究提示，NR1和NR2亚单位可以通过细胞内C末端磷酸化作用调控NMDA受体的细胞信号转导、受体成簇以及突触定位，调节受体与多种胞内蛋白的相互作用[3]，进一步提示C末端是激酶/磷酸酶系统进行修饰特定的分子靶点。研究表明，NMDA受体介导的信号传导依赖于该受体磷酸化状态和选择性剪接，以及异聚体通道的装配。通过各种蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性的精细调节而改变NMDA受体磷酸化状态与水平，从而调控受体的生化特性，包括生物合成、信号传递和亚基组装、亚细胞分布，以及受体与各种突触蛋白的相互作用，最终影响兴奋性突触的效能和强度，改变突触可塑性，调节突触的通道功能和受体定位，迅速和可逆地改变细胞内蛋白的功能，对刺激信号的反应高度精确[4]。

目前发现与NMDA受体相关的蛋白激酶主要分为两大类：一类是丝氨酸/苏氨酸激酶，包括cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、钙调蛋白激酶(CaMKⅡ)、酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)、蛋白激酶B(PKB/Akt)；一类是酪氨酸激酶(ErbB)，包括Src、Fyn。

1.1 丝氨酸/苏氨酸磷酸化 在NMDA受体亚单位中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点是众多激酶的调节载体，这些蛋白激酶位点目前在NR1、NR2上被发现。研究发现，特定亚单位位点的磷酸化状态可调节通道活动，NR1的C末端也可以细胞特异性和活动依赖性的调节NR1/NR3A电流的水平和药物敏感性。利用特定的NR1磷酸化位点抗体发现，PKC、PKA都可使NR1的C末端磷酸化，NR1亚单位S890、S896位点被PKC磷酸化，S897位点则是被PKA磷酸化，而且PKC和PKA在大脑中有不同调节作用[5]。另有研究发现，NR1在小脑颗粒细胞中被两种不同的PKC亚型磷酸化，S890优先被PKCγ磷酸化，而S896则是被PKCα磷酸化。因此S890和S896磷酸化有着不同的调控，并在时空分布和特定PKC亚型激活依赖性的受体调控中起着独特的作用[6]。

NR2A有两个PKA磷酸化位点S900和S929，替换NR2A的S900、S929位点基因后测量受体单通道功能，出现明显抗磷酸化表现，这两个位点的去磷酸化可能会导致受体更快地失去活性、更频繁地脱敏[7]。NR2A上存在3个PKC位点，S1291和S1312位点磷酸化可增强NR2A受体电流；S1416磷酸化可降低CaMKⅡ与NR2A结合的亲和力，使CaMKⅡ与PKC两种信号通路交叉对话[8]。另外，研究发现Cdk5可诱导NR2A的S1232磷酸化；抑制Cdk5活性可以防止在小鼠的CA1锥体细胞中诱导LTP[9]。

NR2B有两个PKC磷酸化位点，NR2B的S1303、S1323位点被PKC磷酸化，从而导致体外转染表达形成的功能性NMDA受体的电流变大[10]。其中，S1303也是CaMKⅡ和凋亡相关蛋白激酶1(DAPK1)磷酸化的位点。S1303为这些激酶调节NR2B的共同靶点，CK2介导S1480位点的磷酸化，导致NR2B和突触后密度蛋白95(PSD-95)的相互作用减弱，引起NR2B内化，调节兴奋性突触功能和可塑性。CaMKⅡ可耦合NR2B与CK2形成三分子复合体，通过CaMKⅡ增强CK2介导的NR2B的S1480磷酸化[11]。最近研究发现，NR2B的S1116位点被Cdk5磷酸化，而干扰Cdk5和NR2B相互作用的多肽能减少S1116位点的磷酸化，造成NR2B表面表达增多[12]。NR2B中S1166位点亦被发现是PKA磷酸化的新靶点，该位点去磷酸化会阻断PKA依赖的NMDA受体介导的Ca2+渗透、突触电流、Ca2+在树突棘上的增加[13]。

1.2 酪氨酸磷酸化 蛋白酪氨酸磷酸化调控是蛋白质翻译后修饰的一类快速且重要的功能性调控方式。大量证据表明，NMDA受体的NR2亚单位酪氨酸磷酸化主要是由Src家族激酶介导的[14～17]。基因定点诱变发现，HEK细胞Src/Fyn所致的酪氨酸磷酸化中，NR2A的Y1292、Y1325和Y1387是重要的磷酸化位点，可增强NMDA受体电流。另外，NR2A的Y842去磷酸化可能调节内化网格蛋白AP-2和NMDA受体的相互作用，参与形成内吞性内涵蛋白包被小泡[14]。

NR2B包含四个酪氨酸磷酸化位点，即Y1070、Y1252、Y1336、Y1472。其中Y1472位点磷酸化的主要细胞生物学功能已被研究得比较透彻，Src或Fyn使该位点磷酸化从而阻断NR2B与内化网格蛋白AP-2 的结合，导致因NR2B的内化减少所致的细胞膜表面表达增多[15]。Fyn可磷酸化Y1336位点，抑制该位点的磷酸化则可减弱钙剪切酶对NR2B胞内C末端的剪切，提示了Y1336磷酸化介导的谷氨酸兴奋性毒性中的功能[16]。另外，Fyn过度表达增强了突触膜上NR2B的Y1472和Y1252磷酸化，可通过维持NMDA受体的突触表达和增加NMDA受体对谷氨酸的反应来促进兴奋性细胞死亡[17]。近期发现，Y1070位点被Src家族激酶磷酸化，将Y1070位点由酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)后，全细胞记录电流和生物素化及表面染色的方法，都表明NR2B的表面表达减少[18]。

2 NMDA受体磷酸化调控与神经系统疾病的关系

2.1 精神分裂症 精神分裂症是一种衰弱性精神疾病，NMDA受体功能失调是精神分裂症的关键致病机制。NMDA受体拮抗剂可诱发精神分裂症的认知障碍和消极症状，利用其诱导的精神分裂症动物模型被认为是目前最理想的精神分裂症模型。研究发现，精神分裂症患者NR1亚单位的表达失调，其中NR1亚单位S897的磷酸化作用显著降低，小鼠体内NR1的S897被丙氨酸(A)取代后，这种突变在NMDA受体突触结合和其介导的突触传递中导致严重的损害，从而产生精神疾病相关的社交互动和感觉运动控制方面的行为缺陷[19]。另有研究发现，神经调节蛋白1(NRG1)、ErbB是精神分裂症的易感因子，NRG1-ErbB4信号通常激活Fyn并促进NR2B Y1472的磷酸化，从而增强NMDA受体的功能。在损伤新生大鼠海马造成精神分裂症样行为缺失的实验中，NRG1和ErbB激酶抑制剂可抑制神经元中NRG1诱导的NR2B的磷酸化，改善精神分裂症的行为缺失。NRG1-ErbB4信号系统既能抑制NMDA受体功能导致谷氨酸功能低下，又可影响神经通路传递和突触可塑性，干扰神经元迁移、影响轴突髓鞘化等环节，参与了精神分裂症的发病过程[20]。最近研究发现，孕酮硫酸盐是中枢神经系统内的内源性神经甾类，是一种积极的NMDA受体变构调节剂，可提高小鼠纹状体PKB和糖原合成激酶3β(GSK3β)水平，长期使用可提高海马体NR1亚单位的磷酸化水平，从而通过NMDA受体介导的Akt-GSK3β信号传导途径来改善大鼠的躁动、认知障碍等表现[21]。TrkB激动剂7,8-DHF能显著提高TrkB激活的Y515和Y816位点磷酸化，增加TrkB下游信号级联的磷酸化水平，包括ERK1/2、CaMKⅡ、NMDA受体和AMPA受体，促进海马突触可塑性，进而恢复工作学习能力，逆转精神分裂症的认知缺陷[22]。另有研究发现，5-HT2A受体拮抗剂ITI-007能显著增加小鼠伏隔核中NR2B的磷酸化作用，这一效应能够促进NMDA受体神经信号传递，其原因可能是继发于激活多巴胺受体D1。

2.2 阿尔茨海默病(AD) AD是一种与记忆障碍有关的神经退行性疾病，其特点包括tau蛋白过度磷酸化、β-淀粉样蛋白(Aβ)积累和淀粉样斑块的形成，这些都与突触丧失和认知下降相关。可溶性Aβ低聚物是树突状细胞病理主要神经毒性物质，可与细胞表面朊蛋白结合，导致突触中异常的NMDA受体激活。朊蛋白在突触后密集区与Fyn相互作用，并与Aβ形成复合物，激活的Fyn引起NR2B亚单位的酪氨酸磷酸化。兴奋性毒性可以导致树突棘突处突触可塑性损害和结构功能丧失，最终导致神经元变性坏死。Fyn也可导致tau蛋白过度磷酸化，因而Fyn是AD病理治疗的一个潜在靶点。Fyn激酶阻断剂马赛替尼和塞卡替尼已被证明用于治疗AD模型小鼠有效，目前处于临床试验中。

2.3 创伤性脑损伤(TBI) TBI的存活者常伴有抑郁、认知和运动障碍，其病因多半是大脑重塑的谷氨酸能神经传递异常紊乱导致细胞去极化，引起Na+、Cl-、H2O向细胞内流动，导致急性渗透性细胞肿胀，脑水肿形成，兴奋毒性病因排除后可部分恢复正常。动物实验显示，阻断NMDA受体介导的谷氨酸毒性作用可以减轻TBI所致的神经功能缺损。其机制之一可能是通过抑制SFKs使NR2B的Y1472去磷酸化，增加NMDA受体的内化作用[23]。TBI导致Src抑制性位点Y527的磷酸化明显下调，而它的活化位点Y416也相应降低，表明在TBI发病后SFKs被显著抑制。Src激酶的磷酸化位点的减少导致突触表面NR2表达部分失衡，NMDA受体的内化增多和进一步降解。研究发现，ErbB抑制剂PP2可抑制NR2B磷酸化，并使NR2B亚单位表达恢复到正常水平，因此其可能作为TBI神经外科手术的术前治疗[24]。

2.4 神经病理性疼痛 神经病理性疼痛的生理和病理过程包括神经系统敏感化、内脏疼痛、细胞凋亡及坏死等，与NMDA受体密切相关，其表达亢进能导致脊髓背角神经元痛觉异常敏感性，并使伤害性感觉神经元发生钙超载；同时可诱发细胞内钙敏感性的信号级联反应，使NMDA受体亚基的不同磷酸化位点发生磷酸化，促使线粒体功能紊乱，其释放的凋亡因子可使神经元变性和死亡。神经病理性疼痛潜在的机制涉及PKA、Fyn。在疼痛大鼠模型的脊髓背角神经元内，PKA可使NR1磷酸化增多，抑制NR1的磷酸化被证明可用于治疗神经病理性疼痛。利用注射弗氏佐剂制作的大鼠疼痛模型发现，NR2A和NR2D先天缺陷大鼠的突触后脊髓背角神经元上NR2B亚单位Y1472酪氨酸磷酸化增加[25]。研究发现，Src相关基因敲除的小鼠表现出中枢反应性和机械性神经痛的敏感行为减弱，因此Src功能被认为是痛觉超敏反应的关键。Src抑制剂与沙阿替尼联用能阻断Src与NMDA受体的结合，阻断了NMDA受体的磷酸化，从而降低疼痛的敏感性[26]。除SFKs外，NMDA受体磷酸化水平也由蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)决定。PTPs抑制剂能显著抑制Src活性，减少Src介导的NR2B磷酸化，减少NR2B的突触累积，最终改善病理性疼痛[27]。阿片类药物减轻炎症性疼痛的能力受NMDA受体的负调控，吗啡可增强PKC介导的NR1的C1段的磷酸化，并增强CaMKⅡ的作用，这种途径与吗啡的耐受性有关。PKC的抑制剂可恢复阿片受体与NR1的联系，增强吗啡的止痛效果。肾上腺素能α2受体激动剂右旋美托咪啶可调节脊髓背侧角神经元上NMDA受体的表达、膜受体转运和功能，以及PKC和CaMKⅡ水平，从而有效改善痛觉过敏[28]。

3 展望

迄今为止，NMDA受体上已被鉴定出具有功能意义的有14个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点、9个酪氨酸磷酸化位点，更明确了这些磷酸化位点及其激酶对NMDA受体的功能调控。既然这么多磷酸化位点及其激酶都参与了对NMDA受体功能的调控，那么在神经系统疾病的发生与发展中，各磷酸化位点的变化情况、各蛋白激酶相互调控的功能等问题值得我们进一步探讨，同时未来可能将各种神经系统疾病的发病机理或进展与NMDA受体磷酸化研究结合，以期进一步揭示深层发病机制，发现潜在的干预靶点。