食管鳞癌中miR-204、miR-205相关ceRNA网络构建及部分lncRNA功能分析

马 军， 李雨濛， 李 南， 任凯凯， 马佳康， 孙 佳， 张 进， 苏彦河，袁 翎， 段芳龄

1.郑州大学第二附属医院检验科，河南 郑州 450014；2.郑州大学消化疾病研究所；3.郑州大学第二附属医院肿瘤科；4.郑州大学第二附属医院胸外科；5.河南省肿瘤医院放疗科

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率位于第8位，占所有癌症死亡率的第6位。中国食管癌病例占全球一半以上，每年约有15万人死于这一疾病，是我国癌症相关死亡的第4大病因。食管癌主要有食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌2个亚型，我国ESCC的发病率在90%以上[1]。高死亡率是食管癌的一个典型特征，因此迫切需要新的生物标记物来更精确地诊断和治疗食管癌，尤其是ESCC。

microRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的、长度为20～24个核苷酸的小RNA，在细胞分化、生物发育及疾病发生、发展过程中发挥巨大作用。既往研究表明，miR-204、miR-205可能参与肿瘤的形成与进展[2]，但在食管癌中的研究仍较少。

PANDOLFI等[3]于2011年提出的ceRNA(竞争性内源RNA)假说认为，内源性RNA分子具有miRNA作用位点，可以竞争性地与miRNA结合，从而间接调控miRNA靶基因的作用。ceRNA假说的提出赋予mRNA和非编码RNA新的、更为广泛的生物学功能。不同类型的RNA之间,包括长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)、mRNA等，通过RNA-RNA相互作用所构成的调控网络在病理生理过程中发挥重要作用，包括肿瘤的生成和发展[4]。

lncRNA是长度>200个核苷酸的非编码 RNA[5]，在细胞分化、个体发育过程中发挥着重要作用，与人类众多疾病的发生、发展都有着密切的联系。有研究[6]表明，lncRNA可能在肿瘤的发生、发展、浸润、转移中发挥关键作用。

本研究用TCGA数据库中ESCC相关转录组数据，筛选出差异表达的mRNA、lncRNA及miRNA，成功构建了miR-204、miR-205相关lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络，并找出与亚洲ESCC患者生存相关的lncRNA。通过对7个同时调节miR-204、miR-205的lncRNA的靶基因进行GO、KEGG、蛋白互作(PPI)网络等分析，预测这些lncRNA在亚洲ESCC中的临床意义、分子调控机制，为ESCC的诊断和治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1TCGA数据下载及差异基因筛选从TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)数据库下载ESCC mRNA、miRNA的测序数据及临床信息。截至2018年2月23日，数据库中收录ESCC mRNA测序数据92例，其中81例ESCC组织样本及11例癌旁正常组织样本；收录miRNA ESCC测序数据108例，包括ESCC组织样本95例，癌旁正常组织样本13例。其中亚洲ESCC mRNA测序样本37例，miRNA测序样本44例。使用R语言“edgeR”包筛选差异基因，筛选条件为：log 2-fold change (logFC)>2且P<0.05。

1.2ceRNA网络构建筛选出的差异lncRNA、差异miRNA在miRcode数据库中进行配对。利用starBase在线软件(http://starbase.sysu.edu.cn/)对筛选出的差异miRNA进行靶基因预测，miRDB、miRTarBase、TargetScan 3个数据库预测靶基因，从而得到lncRNA-miRNA-mRNA 的ceRNA调控网络,利用Cytoscape v3.5.1软件制图。

1.3生存分析利用TCGA数据库中亚洲人ESCC的生存时间，采用的是R语言中的“Survival”软件包，对特异的lncRNA进行生存分析，P<0.05被认为差异有统计学意义。

1.4lncRNA靶基因预测、GO及KEGG分析lncRNA靶基因预测利用MEM(https://biit.cs.ut.ee/mem/)在线分析，每个lncRNA选取200个靶基因进行下一步分析。GO、KEGG使用Cytoscape中的“ClueGO”、“CluePedia”APP完成，筛选标准为P<0.05。

1.5蛋白互作网络利用在线软件STRING(https://string-db.org/)寻找蛋白质之间的相互作用关系。相关图表利用Cytoscape中的“stringAPP”完成，并删除未出现在互作网络中的蛋白质。

2 结果

2.1ESCC差异基因筛选及miR-204、miR-205相关ceRNA网络构建TCGA数据库中ESCC的转录组测序数据分析，共筛选出差异lncRNA 1 160个、mRNA 2 064个、miRNA 69个。通过ceRNA网络构建发现，miR-204、miR-205是ESCC中重要的节点基因，提取其相关的lncRNA 38个、mRNA 13个，并成功构建了以miR-204/205为节点的ceRNA调控网络。其中FER1L6-AS1、MIR205HG、TM4SF19-AS1、ADAMTS9-AS2、HOTTIP、LINC00520、SOX2-OT、LINC00524和 RMST这9个lncRNA可同时调控miRNA-204及miRNA-205(见图1)。

2.2miR-204、miR-205相关lncRNA生存分析为了研究差异基因与亚洲ESCC患者总生存期的关系，我们对miR-204、miR-205相关的lncRNA、mRNA进行OS分析，结果显示，FER1L6-AS1和LINC00504与亚洲ESCC患者生存显著相关(见图2)，未发现与亚洲ESCC患者生存相关的mRNA(见表1)。

2.3lncRNA靶基因预测及GO、KEGG分析用MEM在线软件对9个lncRNA进行靶基因预测，LINC00524和TM4SF19-AS1未预测出下游靶基因，其余7个lncRNA根据相关性选取前200个作为目标靶基因,去除重复值后共有1 165个靶基因。1 165个预测靶基因在TCGA中2 064个差异表达mRNA中验证，筛选出141个mRNA作为最终靶基因。GO分析共发现9个细胞成分、7个分子功能相关富集，主要参与细胞间连接、突触、通道活性、被动跨膜转运蛋白活性等功能。KEGG分析发现4条相关通路，包括神经活性配体-受体相互作用、逆行内源性大麻素信号、GABA能突触、吗啡成瘾等通路(见图3)。

注：红色代表上调基因，蓝色代表下调基因。三角形、圆形及八边形分别代表miRNA、lncRNA和mRNA。

lncRNAGeneID基因坐标(hg19)表达水平P值FDRFER1L6-AS1ENSG00000181171chr8:123,984,138-124,040,782下调2.06E-075.24E-06LINC00504ENSG00000248360chr4:14,470,465-14,888,169上调0.00130.0085

图2 亚洲人ESCC生存相关lncRNA Kaplan-Meier生存曲线

图3 lncRNA靶基因GO、KEGG分析

2.4PPI网络构建141个靶基因通过STRING在线分析其相应编码蛋白质之间的相互作用关系，结果显示,54个编码蛋白质形成包含67个互相作用关系的蛋白互作网络(见图4)。从图中可以看出：GNG7、ADCY5、NMUR2、PTGER3、KPT5位于网络的中心，与多种蛋白质之间存在相互作用。

图4 lncRNA靶基因编码蛋白PPI网络

3 讨论

miRNA是目前研究最多的非编码RNA，它可以作为癌基因或抑癌基因[7]，在肿瘤的生成、侵袭、转移等病理过程中发挥重要作用。既往研究[2]表明,miR-204、miR-205与多种肿瘤的形成与进展关系密切。

miR-204在ESCC细胞(EC109、TE10)中，可以下调(FOXM1)，从而抑制瘤细胞增殖[8]；术后复发的ESCC患者miR-204表达降低[9]；在ESCC中，miR-204作为ceRNA成员，其作用可被lncRNA UCA1竞争，从而解除miR-204对SOX4基因的抑制，促进ESCC细胞增殖[10]。我们的分析结果发现，miR-204在ESCC中表达下调，这表明miR-204可能作为抑癌基因参与ESCC的形成与进展。

在ESCC中，生活方式可能改变miR-205在肿瘤组织中的表达，吸烟可以使肿瘤组织miR-205表达增高，而酗酒可以使其表达降低[11]。PAN等[12]发现，miR-205能促进ESCC细胞EMT活性、抑制凋亡，并通过DNA修复信号通路促进放疗抵抗，因此,在ESCC中，miR-205起着癌基因的作用。然而，MATSUSHIMA等[13]基因芯片结果显示，尽管在ESCC中miR-205高表达，但表现为抑癌基因作用，可以抑制瘤细胞侵袭和迁移，并通过抑制其靶基因ZEB2，抑制瘤细胞EMT活性；而且，XU等[14]也发现，miR-205可以在ESCC患者血中表达下降。HEZOVA等[15]的实验显示，miR-205在不组织类型的食管癌中，作用不同，在食管腺癌中表现为抑癌基因，而在ESCC表现为癌基因。

越来越多的证据表明，ceRNA在基因表达的调节中具有重要的作用，并参与肿瘤的生成与进展[16]。目前文献ESCC中ceRNA调控网络已经发现很多，但miR-205在ESCC中的ceRNA网络还未见报道，miR-204的ceRNA网络文献报道的仅有UCA1-miR-204-SOX4，因此，ESCC中lncRNA相关的ceRNA调控机制仍需要进一步深入研究。在本研究中，我们发现，miR-204和miR-205是ESCC ceRNA网络中关键的调控节点，以此为节点，这一调控网络的预测可能对研究ESCC生成、进展相关机制提供新的方法。

对ceRNA网络分析发现，9个lncRNA可同时调控miR-204及miR-205，我们推测这些lncRNA与ESCC关系密切。其中LINC00504与患者的生存呈负相关，其表达量越高患者的生存时间越短；FER1L6-AS1与患者生存呈正相关，表达量越高患者生存时间越长。这表明FER1L6-AS1和LINC00504可能是ESCC患者预后的生物标志物。

另外，这些lncRNA的靶基因与细胞间连接、突触、通道活性、被动跨膜转运蛋白活性等功能及神经活性配体—受体相互作用、逆行内源性大麻素信号、GABA能突触、吗啡成瘾等通路显著相关，可能参与ESCC的形成与进展。PPI网络为我们进一步研究lncRNA对基因的调控和在ESCC中的作用机制有积极的提示价值。

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