响应面优化超声辅助提取桂皮总黄酮的工艺研究

赵世霞

(淄博职业学院，山东 淄博 255314)

桂皮，别名官桂或香桂，为天竺桂、肉桂或川桂等樟科植物树皮的通称[1,2]，在我国主要产于云南、广西等地。桂皮是典型的食药同源品种[3]，作为传统的中药材，其具有暖胃祛寒、通脉止痛、散瘀消肿、止泻、活血舒筋等功效；作为古老的香辛调味品，其广泛用于肉类菜肴的祛腥解腻及五香粉的加工[4]。现代药理学实验表明桂皮含有挥发油、多糖类、皂苷类、萜类、酚类、黄酮类等多种化学活性物质，在消化、心血管、免疫及内分泌相关疾病的预防和治疗中发挥着重要作用[5]。近年来，随着人们对健康的重视，作为桂皮主要成分之一的黄酮类化合物由于具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、增强免疫力等作用而受到国内外学者及大型公司的广泛 关注，其在药品、保健食品、食品添加剂、功能性饮料、消毒剂等领域极具开发价值[6,7]。

目前，黄酮类化合物的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、微波或超声辅助提取法、有机溶剂提取法等[8]。超声辅助提取具有效率高、质量稳定、安全性高、耗能低等特点，近年来被广泛应用于活性物质的提取[9,10]。本研究选用乙醇作为提取溶剂，采用超声辅助提取法对桂皮总黄酮化合物的提取工艺进行优化，以期为桂皮的二次开发提供一定的思路与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桂皮：市售，经洗净、烘干、粉碎后过60目筛备用；芦丁标准品：酷尔化学科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：均为国产分析纯。

1.2 仪器

DHG-9145A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HZY-C500型电子天平 河南兄弟仪器设备有限公司；UV-5100B型紫外分光光度计 无锡久平仪器有限公司；FW135型中草药粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 江苏同君仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 总黄酮含量的测定

以芦丁为标准品，采用比色法测定510 nm处吸光度[11]。以质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，A=9.3971C-0.0039，R2=0.9988。利用标准曲线计算样品总黄酮含量，桂皮中总黄酮提取率按下式计算：

总黄酮提取率=(提取总黄酮的质量/桂皮粉末质量)×100%。

1.3.2 桂皮总黄酮的提取

精确称取桂皮干燥粉末10.00 g，按一定液料比(mL/g)15∶1加入60%的乙醇溶剂，在600 W额定超声功率下提取 60 min，提取液冷却后过滤，滤液减压浓缩至30～40 mL，过0.45 μm滤膜，转移至100 mL容量瓶中，60%乙醇定容，摇匀后取1 mL提取液测定总黄酮含量，计算提取率。

1.3.3 单因素试验

单因素试验按1.3.2步骤进行桂皮总黄酮的提取，分别以不同的液料比(mL/g)10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，不同乙醇浓度40%，50%，60%，70%，80%，90%，不同超声功率300，400，500，600，700，800 W，不同提取时间20,40,60,80,100 min为单因素，考察单因素对桂皮总黄酮提取的影响，试验重复3次。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验结果，采用Box-Benhnken试验设计对桂皮总黄酮的提取工艺进行响应面优化，试验设计见表1，试验重复3次。

2 结果

2.1 单因素优化试验

图1 单因素条件对桂皮总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of single factor on the extraction rate of flavonoids from cinnamon

由图1中A可知，桂皮总黄酮提取率随着液料比的增加呈典型的倒“V”型变化趋势，当液料比为20∶1时，提取桂皮总黄酮的效果最佳。这是因为液料比低时，桂皮粉末得不到充分浸润；增加液料比，黄酮类化合物的扩散和溶出速率的提高有利于桂皮总黄酮的提取；液料比过高时，非黄酮类可溶杂质溶出增加，导致桂皮总黄酮提取率下降。因此，选择液料比20∶1较为合适。由图1中B可知，桂皮总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而快速增加，当乙醇浓度为70%时，桂皮总黄酮提取率最大，达到4.52%，随后桂皮总黄酮提取率开始下降。这是由于随着乙醇体积分数增大，提取液极性开始下降，黄酮类化合物由于相似相溶而不断溶出；当乙醇浓度过高时，粘度变大，极性过低，不利于黄酮类化合物溶出，同时溶出的醇溶性杂质增多，导致桂皮总黄酮提取率下降。因此，选择乙醇浓度70%较为适宜。由图1中C可知，随着超声功率的增加，桂皮总黄酮提取率先快速增加而后缓慢下降。随着超声功率增加，分子扩散加快，桂皮总黄酮提取率增加，但当超声功率过大时，局部升温过快，造成苷键水解和色素的溶出，导致桂皮总黄酮提取率下降。因此，选择超声功率500 W为宜。由图1中D可知，随着提取时间的延长，桂皮总黄酮提取率呈先增后减的趋势；提取60 min时，总黄酮提取率达到最大，为5.01%。延长提取时间可以提高总黄酮提取率，但是时间过长导致桂皮总黄酮发生降解，提取率随之下降。因此，选择提取时间60 min较佳。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 试验设计与结果

根据2.1中试验结果，以液料比20∶1、乙醇浓度70%、超声功率500 W、提取时间60 min为中心点，桂皮总黄酮提取率为响应值，通过Design Expert 8.0软件，运用Box-Benhnken中心组合试验设计原理进行四因素三水平的响应面试验设计，试验方案设计与结果见表1。

表1 桂皮总黄酮提取的响应面试验设计方案及结果Table 1 Response surface methodology design scheme and results for extraction of total flavonoids from cinnamon

续 表

2.2.2 方差分析与显著性检验

对表1的数据进行二次回归拟合，得桂皮总黄酮提取率(Y)与液料比(A)、乙醇浓度(B)、超声功率(C)、提取时间(D)4个因素之间的二次回归方程：

Y=-84.67458+2.00067A+0.98025B+0.075442C+0.54600D+5.00000E-005AB-4.85000E-004AC-6.00000E-004AD-2.57500E-004BC+1.82500E-003BD-2.35000E-004CD-0.041267A2-6.90417E-003B2-3.54167E-005C2-4.40417E-003D2。

方程的二次项系数为负值，表明方程代表的抛物面开口向下，具有极值点，可以进行优化分析。以桂皮总黄酮提取率为响应值，根据表1试验结果，对桂皮总黄酮提取工艺模型进行回归分析，结果见表2。

表2 桂皮总黄酮提取二次多项式模型的方差分析Table 2 Variance analysis of quadratic polynomial model of total flavonoids extracted from cinnamon

由表2可知，回归模型显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.085)，说明该模型拟合充分，能够用来描述桂皮总黄酮提取率与提取条件的关系。模型相关系数R2=0.9913，表明该模型可以解释响应面中99.13%的可变性，可以用于桂皮在总黄酮提取最佳条件的确定。方程一次项中A，C，D，二次项中A2，B2，C2，D2，交互项中AC，BC，BD，CD对桂皮在总黄酮提取率影响最为显著(P<0.0001)，其他项不显著(P>0.05)，表明各因素之间影响是非线性关系。模型中根据F值大小可知，影响桂皮在总黄酮提取效果的因素按主次顺序排列为：液料比(A)>超声功率(C)>提取时间(D)>乙醇浓度(B)。

2.2.3 响应面分析

图2 各因素交互效应对桂皮总黄酮提取率影响的响应图Fig.2 Interactive effects of each factor on the extraction of flavonoids from cinnamon

响应曲面图可以直观地反映各因素相互作用对响应值的影响。其中曲线越陡峭，表明操作条件对响应值影响越显著。

由图2可知，乙醇浓度与超声功率曲面最为陡峭，料液比与超声功率、超声功率与提取时间、乙醇浓度与提取时间均较为陡峭，可见这些因素的交互作用对桂皮总黄酮的提取率影响比较显著，这与上述方差分析和显著性检验正好相符。

2.3 验证试验

通过响应面试验分析，确定桂皮总黄酮最佳提取条件为：液料比21.17∶1，乙醇浓度70.99%，超声功率452.39 W，超声处理时间63.19 min，在此条件下桂皮黄酮提取率的最大预测值为5.60%。考虑实际过程中的局限性，将工艺条件优化为液料比21∶1，乙醇浓度71%，超声功率452 W，提取时间63 min。在此条件下进行3次验证，得到桂皮总黄酮平均提取率为5.61%，与模型预测值接近，表明构建的模型对桂皮总黄酮提取工艺的模拟是可靠的。

3 结论

超声提取法就是利用超声波的空化效应、机械效应和热效应，加速活性成分进入溶剂，同时粉碎植物细胞，使活性成分快速释放至胞外，提取效率高[12]。黄酮类化合物在植物中广泛分布，是植物经光合作用产生的一类天然产物，常以游离态或与糖苷形式存在[13]，具有广泛的药理活性，食用和药用价值均比较高。桂皮作为古老而悠久的香辛料，含有丰富的黄酮类化合物。本文以桂皮总黄酮为研究对象，选用超声辅助提取法，通过单因素试验和响应面设计对其提取工艺进行优化，获得最佳提取工艺条件为：液料比21∶1，乙醇浓度71%，超声功率452 W，提取时间63 min，在此条件下桂皮总黄酮提取率为5.61%，与理论预测值(5.60%)基本一致。本研究为桂皮总黄酮的工业提取利用以及香辛料的科学开发提供了一定的科学依据。

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