复方丹参滴丸对2型糖尿病大鼠代谢、生化指标及缺氧诱导因子-1α/血管内皮生长因子通路的影响

王 薇 王怀清 杨建明 王 稳

(宜昌市第一人民医院暨三峡大学人民医院内分泌科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症之一，也是导致患者出现终末期肾衰竭的重要病因。有学者提出，高血糖时红细胞携氧能力降低，引起肾组织缺氧，导致肾组织病理生理学的改变是推动2型糖尿病(T2DM)向终末期肾病进展的重要通路〔1〕。缺氧诱导因子(HIF)-1α是机体缺氧状态时的重要转录因子，可通过特异性结合靶基因缺氧反应元件(HRE)而启动靶基因转录，从而发挥生理作用〔2〕。血管内皮生长因子(VEGF)是具有该结合位点的一类靶基因，具有促进血管内皮细胞增殖、增强血管通透性等作用〔3〕。近年来学者发现〔4〕，HIF-1α/VEGF通路激活可能是糖尿病肾病的重要发生机制。复方丹参滴丸(DSP)是目前临床中用于缓解和治疗糖尿病肾脏病变、冠心病等的常见药物之一，但具体作用途径及机制尚不明确。本文主要研究DSP对T2DM大鼠HIF-1α/VEGF通路的影响及其作用效果。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取48只6～8周龄的清洁级健康雄性SD大鼠，体重180～210 g，由上海灵畅生物科技有限公司提供，实验动物生产合格证号：SCXK(沪)2013-0018。以基础饲料适应性喂养1 w，室温(25.0±2.0)℃，湿度45%～70%，自然光照，室内保持安静。

1.2动物分组与造模 按简单随机抽样方法将48只大鼠随机分为对照组(NC组，n=10)和造模组(n=38)。对照组给予常规饲料喂养；造模组采用高糖高脂饲料喂养4 w后，一次性腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ)溶液，剂量为30 mg/kg，2 h后恢复高糖高脂饲料喂养，72 h后采集尾静脉血，以优越型血糖仪(ACCU CHEK Advantage，瑞士罗氏诊断公司)测定2次随机血糖(RBG)，两次RBG值均≥16.7 mmol/L则判定为T2DM模型造模成功。本次共有32只大鼠成模，成功率为84.21%。将成模的32只大鼠依据血糖水平分为糖尿病对照组(DM组，n=16)和DSP治疗组(DSP组，n=16)，其中DSP组大鼠在STZ注射1 w后给予400 mg·kg-1·d-1的DSP(天士力制药集团股份有限公司，批准文号：国药准字Z10950111，规格：薄膜衣滴丸每丸重27 mg)与生理盐水混悬液治疗；NC组及DM组大鼠给予等量的生理盐水灌胃，均持续8 w。

1.3处理方法 灌胃最后1 d，留取大鼠24 h尿液，用于24 h尿微量白蛋白(24 h UAlb)的测定。第2天对三组大鼠腹腔注射1%水合氯醛全麻，剂量为40～50 mg/kg。真空管采集下腔静脉血8 ml，3 000 r/min离心10 min后，取上清夜，-20℃保存，用于糖代谢及生化指标的测定。同时剖腹快速摘取两侧肾脏组织，以冰生理盐水原位灌洗，洗净附着的血细胞，分离肾背膜、周围脂肪组织及血管蒂，电子天平称量右肾组织。将肾组织放置于冰袋上，剪取大小约为2 cm×2 cm的肾皮质组织块，经10%中性甲醛液固定后进行常规石蜡包埋，以切片机制成厚度为2 μm的连续切片，分别经过脱蜡、水化等处理后，以PASM染色后行免疫组化检测。将剩余肾脏组织置于冻存管内，-70℃保存。

1.4观察指标与方法

1.4.1三组大鼠糖脂代谢及生化指标的检测 分别采用AU2700全自动生化仪(日本Olympus公司)和自动放射免疫仪(北京百思佳特科技有限责任公司)检测空腹血糖(FPG)及空腹胰岛素(FIns)水平；24 h UAlb采用BNII全自动蛋白分析仪(德国西门子公司)检测，其含量=尿微量白蛋白的浓度×总尿量；血脂代谢指标：总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及生化指标：肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的测定均采用AU2700全自动生化仪进行测定；胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)由计算公式FIns×FPG/22.5得到。

1.4.2三组大鼠肾小球细胞外基质(ECM)堆积指数的测定 高倍镜视野下(×400)随机观察20个不重复的肾小球，通过观察PASM的染色结果，以判断ECM的堆积情况，从而对肾小球的病变状况进行评估。以ECM占据肾小球面积百分比为判定标准，其中百分比为0%～25%计为0分，26%～50%计为1分，51%～75%计为3分，76%以上计为4分。三组随机选取5只大鼠，以平均积分作为三组ECM堆积指数。

1.4.3三组大鼠肾组织中HIF-1α及VEGF表达水平的检测 采用Western印迹方法进行检测：剪取右肾皮质组织约100 mg，以磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗后，加入4℃预冷的组织裂解A液、B液，置于振荡器中摇匀5 min后，冰浴静置20 min以提取总蛋白，4℃ 14 000 r/min离心30 s后吸取上清液，置于EP管中，-70℃冻存。采用聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质进行电泳，将蛋白质转移至PVDF膜上。后经由甲醇浸泡、缓冲液平衡、转移、脱色等过程后，将PVDF膜(美国Millpore公司)放入一定大小的自封袋内，以0.1 ml/cm2的剂量加入10%的脱脂奶粉(以0.05%的TBST溶解)，室温封闭2～4 h后移至另一自封袋中，迅速加入剂量为1 ml/cm2的一抗(HIF-1α购自北京博奥森生物技术有限公司，VEGF购自北京中杉金桥生物技术有限公司，均以封闭液稀释浓度为1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，密封后置摇床孵育2 h，4℃过夜。后取出PVDF膜，以TBS液漂洗4次，每次10 min。加入二抗(北京百奥莱博科技有限公司)，封闭、室温摇床孵育2～3 h，以TBS液漂洗4次，每次10 min。加入Western印迹Lumininol Reagent A液和B液(美国Santa Cruz公司)后，充分混匀，固定于微型曝光盒中送入暗室曝光。以Fluor-s凝胶成像系统(美国Bio Rad公司)分析目的条带，以目的蛋白的吸光密度×面积与β-actin条带的比值表示待测蛋白的相对含量。

1.5统计学方法 应用SPSS21.0软件，计量资料组间两两比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。

2 结 果

2.1三组病理检查结果及ECM堆积指数比较 NC组肾小球结构正常，基底膜及系膜区未见明显增厚、扩张现象，而DM组及DSP组肾小球基底膜及系膜区呈现明显肿胀、扩张，DSP组肾小球病变有所减轻。三组大鼠肾小球ECM堆积指数的积分结果显示，NC组(1.43±0.54)分，DM组(20.56±0.92)分，DSP组(11.80±1.63)分，三组ECM堆积指数整体比较差异均有统计学意义(F=802.819，P<0.05)。DM组及DSP组肾小球ECM堆积指数积分均显著高于NC组，且DSP组显著低于DM组(t=-59.396、-19.336、-18.721，均P=0.000)。

2.2三组血清糖脂代谢指标水平比较 三组血清中糖脂代谢指标水平整体比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较，DM组及DSP组血清FPG、FIns、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平均显著升高，而HDL-C水平显著降低(P<0.05)；除HDL-C外，DSP组其他指标水平均显著低于DM组(P<0.05)。见表1。

2.3三组血清生化指标水平比较 DM组及DSP组Scr、BUN及24 h UAlb水平明显高于NC组，DSP组明显低于DM组(P<0.05)。见表2。

表1 三组血清糖、脂代谢指标水平比较

与NC组比较：1)P<0.05；与DM组比较：2)P<0.05；下表同

表2 三组血清中生化指标水平比较

2.4三组肾组织中HIF-1α及VEGF表达水平比较 DM组与DSP组肾组织中HIF-1α及VEGF相对含量均显著高于NC组，DSP组显著低于DM组(均P<0.05)。见表3。

表3 三组大鼠肾组织中HIF-1α及VEGF相对含量比较

3 讨 论

糖尿病肾病是导致糖尿病患者发生终末期肾衰竭的一类常见并发症，发生率为20%～40%，若不进行及早治疗，一旦发展为终末期肾病，将缩短患者的5年生存率〔5〕。糖尿病肾病的具体发生机制尚未完全阐明，学者普遍认为其与遗传易感性、氧化应激机制、细胞因子和生长因子异常增高、多元醇代谢旁路、蛋白激酶C等多种因素及环节密切相关〔6〕。HIF-1α/VEGF通路激活导致肾组织产生血管内皮增生、内皮细胞通透性增加等一系列病理生理改变，已成为学者们研究糖尿病相关并发症发生机制新的研究方向。

DSP是临床中广泛用于治疗心血管疾病的一类中成药，以丹参、冰片和三七等为主要成分，具有缓解心绞痛、改善血管微循环等作用〔7〕。本次研究结果示，DSP组与DM组大鼠肾小球均呈现一定程度的病变，提示DSP可有效改善T2DM所致的肾脏病变。研究进一步发现，DSP可有效改善T2DM肾病大鼠的糖脂代谢及肾功能，分析原因为DSP具有改善微循环障碍、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、清除自由基、调节血脂等多靶点作用，从而改善胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗〔8〕。

HIF-1α/VEGF通路激活是目前研究较多的造成肾脏疾病的重要机制，HIF-1α是细胞内调节氧代谢的关键因子之一，可稳定细胞的缺氧状态，是目前发现的唯一一种可在特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子〔9〕。T2DM早期的高糖毒性可引起机体缺氧，从而激活机体HIF-1α的大量积聚，HIF-1α可通过特异性结合具有HRE结构的下游靶基因，如VEGF等，从而发挥促进血管生成及增强血管通透性的作用，故可见早期肾病诊断指标24 h UAlb水平大大增加〔10〕。有研究以该通路为新的思路，发现格列齐特、苦瓜总皂苷、罗格列酮等对于延缓T2DM所致肾脏损害的进展具有显著效果〔11～13〕。DSP对T2DM的改善作用是否与HIF-1α及VEGF通路有关，本文进行了进一步的探索。结果说明HIF-1α及VEGF可能参与T2DM肾病的发生发展过程，DSP对T2DM肾损伤的改善作用机制可能与其对HIF-1α/VEGF通路的调控作用有关。

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