慢性阻塞性肺病大鼠血浆白三烯C4水平、细胞免疫及支气管上皮多药耐药相关蛋白1 mRNA和蛋白水平的变化

黄燕玲 罗光伟 毛莉娜

(武汉市第一医院呼吸内科，湖北 武汉 430022)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是中老年人的常见病和多发病，许多患者最终因呼吸衰竭或慢性肺源性心脏病而死亡〔1～3〕。白三烯(LT)C4是和谷胱甘肽共轭的炎症产物，与COPD 患者的支气管黏膜炎症、支气管平滑肌收缩和气道重构的关联仍未清晰阐明〔4〕；另外多药耐药相关蛋白(MRP)1与LTC4有较高亲和力〔5〕。本研究探讨COPD大鼠血浆LTC4、T淋巴细胞亚群和支气管上皮MRP1 mRNA表达与COPD的相关性。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，体重180～220 g，购于武汉大学医学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2003-0004。随机分为模型组和正常对照组各10只。

1.2COPD模型制备 于大鼠气管内注入脂多糖(LPS)加熏香烟方法制备COPD模型。在第1天和第14天，将大鼠全麻，于气道注入溶于生理盐水的LPS 200 μl(1 mg/ml)，正常对照组注入生理盐水。第2～28天(第14天除外)将COPD组置入自制被动熏吸箱内(50 cm×50 cm×50 cm)，注入香烟烟雾(牡丹牌香烟，上海卷烟厂生产，焦油、尼古丁和一氧化碳(CO)的含量分别为11.0 mg/支、0.9 mg/支和12 mg/支)，浓度5%，1 h/次，2次/d。正常对照组不进行熏吸。

1.3指标检测 ①呼吸功能测定：采用动物肺功能测定系统检测肺功能，即1 s用力呼气容积占用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、呼气峰流速(PEF)和肺顺应性(Cydn)。采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于操作台，测定肺功能。②酶免疫法检测血浆LTC4：大鼠处死前经颈总动脉采血3 ml，立即注入预冷的含乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)(1 mg/ml)试管中抗凝，4℃，2 000 r/min离心10 min，分离血浆，-70℃保存，备用。采用LTC4 酶免疫检测试剂盒(美国Cayman Chemical公司)测定大鼠血浆中LTC4水平，具体操作按说明书进行。③T细胞亚群检测：收集造模前后大鼠的尾巴血1 ml，采用流式细胞仪检测血T细胞及亚群。④反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析MRP1 mRNA表达：用Trizol法提取肺组织中总RNA。MMLV逆转录酶和多聚体(Oligo)(dT)37℃下逆转录5 min，42℃ 1 h逆转录为单链cDNA。PCR扩增：采用Taq DNA多聚酶和正反引物(MRP1 上游：5′-CATTGACCCTATCTAACTT-3′，下游:5′-AGGAGAACCATAACCC-3′,208 bp;β-actin上游:5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′,5′-CACGTCACACTTCATGATGGAG-3′，224 bp)。存在下进行PCR，用β-actin和Marker D512为参照物，按以下步骤行PCR扩增：94℃变性，30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个周期。目标基因检测：采用琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果并进行拍照。采用Quantityone4.6.2分析结果。⑤肺组织标本病理：夹闭左主支气管，将硅胶管固定于右主支气，检测之前将血浆标本用SepPack C18(美国Cayman Chemical公司)分离柱抽提，洗出液用N2吹干，置入试管内，右肺内注射10%甲醛至右肺膨胀边缘变锐，结扎右主支气管，置于10%甲醛中固定、脱水、包埋、苏木素-伊红(HE)染色并行病理检查。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0软件进行One Way ANOVA分析。

2 结 果

2.1两组体重比较 实验期间，模型组精神反应、活动和毛发较正常对照组差，入组前两组体重差异无统计学意义(P>0.05)，模型组体重增重缓慢，较正常对照组明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 两组造模前后体重比较

2.2两组造模后肺功能比较 两组肺功能差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3两组造模后血浆LTC4水平比较 与正常对照组〔(1 102.5±188.2)pg/ml〕比较，模型组血浆LTC4水平〔(2 285.4±183.1)pg/ml〕明显增高(P<0.01)。

2.4两组造模前后外周血T细胞亚群比较 造模前，两组CD3+、CD4+和CD8+差异无统计学意义(P>0.05)；造模后，与正常对照组比，模型组CD3+有降低趋势，但差异无统计学意义，CD4+明显降低(P<0.001)，CD8+明显增高(P<0.05)，见表2。

表2 两组造模前后外周血T细胞亚群及造模后肺功能比较

2.5两组肺组织中MRP1 mRNA表达 各扩增条带曲线下的光密度值Aa与β-actin扩增条带的光密度值Ab，结果以Aa/Ab×100%表示，与正常对照组〔(3.875±0.658)%〕比较，模型组光密度比值明显较低〔(1.790±0.410)%，P<0.05〕，RT-PCR产物凝胶电泳也可看见模型组MRP1 mRNA表达较弱，见图1。

图1 MRP1 mRNART-PCR产物凝胶电泳图

图2 两组肺支气管病理学变化(HE，×400)

2.6两组肺组织形态学病理的变化 由图2所示，正常对照组支气管黏膜纤毛柱状上皮呈整齐排列，黏膜与固有层的细胞数较少，可见少数杯状细胞，各级支气管壁黏膜上皮未见大量炎症细胞浸润，肺泡完整正常；模型组气管、支气管黏膜上皮纤毛大量倒伏和脱落，杯状细胞明显增多，各级支气管管壁周围大量炎症细胞浸润，肺泡断裂，肺泡壁变薄，腔体扩大。与正常对照组比，模型组肺组织存在明显的损伤。

3 讨 论

COPD发生时，肺不同部位的肺泡巨噬细胞、T 淋巴细胞和中性粒细胞表达增加，炎症细胞被激活释放大量炎症介质，如LTC4、肿瘤坏死因子和白细胞介素等，其中LTC4是和谷胱甘肽共轭的产物，通过增加毛细静脉的通透性，收缩血管和诱导氧化应激收缩支气管平滑肌，促进气道平滑肌增殖，增加液体渗出，进而破坏肺实体结构，导致气道重构〔6～8〕。本研究结果印证了LTC4参与了COPD的发生发展过程，也显示COPD患者的血浆的LTC4表达与COPD严重程度呈正相关关系〔8～10〕，可见临床可以LTC4水平为COPD患者提供个体化治疗方案或治疗COPD的新药可将LTC4作为药效靶点。

COPD的发病机制不仅在于肺部出现炎症反应，还在于全身免疫系统的变化。T淋巴细胞除了参与COPD的炎症过程，还参与调整COPD的免疫功能，从COPD肺泡关系液可检测到CD4+和CD8+存在明显的变化，本研究结果提示肺部感染的COPD患者细胞免疫显著降低，对外来异物的免疫监控功能降低，导致病毒、细菌等具有抗原性的异物极容易侵入机体进而加重COPD的病情，致使病情延绵不断甚至死亡，免疫调节指数降低程度与COPD的严重程度呈负相关〔11～13〕。

肺支气管细胞可表达三磷酸腺苷结合盒(ABC)类转运体，ABC类转运体可吸入体外的化学异物或有毒物质，通过外排功能达到肺减毒的效应，作为肺的天然屏障，其家族中的重要一员MRP1在健康人肺支气管上皮有较强的表达。因为MRP1具有较广泛的跨膜转运功能和较多的结合底物，使得MRP1通过作用于内源性代谢物，调节细胞内药物、毒物和药物代谢产物水平达到调节肺组织氧化应激，减少毒物或异物对人体的损害，是机体天然的防御解毒的重要组成部分。MRP1 对LTC4具有较高的亲和力，LTC4与MRP1结合并与MRP1一起排出到细胞外，因此COPD患者支气管上皮细胞的MRP1表达降低，重度COPD较中等COPD的支气管上皮细胞的MRP1表达更少，随着病程的加重，MRPI表达随之降低。MRP1在COPD的发生发展过程起保护作用〔14～18〕。

综上，采用气管注脂多糖加熏香烟方法复制COPD大鼠模型与临床COPD具有明显的病理相似性，LTC4很可能参与了COPD支气管黏膜炎症、支气管平滑肌收缩和气道重构过程；T淋巴细胞失衡提示COPD的细胞免疫功能降低，造成COPD病情延绵难治；MRP1在COPD过程中起保护作用，临床治疗时可根据LTC4、T淋巴细胞和MRP1的表达为COPD患者制定治疗方案，用于治疗COPD的新药可将降低LTC4、平衡T淋巴细胞或增加MRP1水平作为疗效靶点。

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