植物毒素

隋友华

植物毒素是由植物产生的能引起人和动物疾病的有毒物质。植物毒素的产生主要缘于植物在系统发育过程中的自我保护和防御机制，即植物抵抗对生物或非生物胁迫反应而产生的代谢物，对某些化学元素的富集机制，以及植物在数亿年的遗传分化中，在各种环境的影响和遗传物质发生改变的双重作用下形成的生物多样化。植物毒素的概念是MULLER和BORGER于1940年在马铃薯晚疫病研究当中首次提出的，他们发现当马铃薯块茎被一种不相容的晚疫病生理小种侵染以后，植株对后来相容性晚疫病生理小种的侵染表现出抗性，因此他们假设在马铃薯受到不相容性晚疫病生理小种侵染以后，诱导产生了某种物质（植物毒素）会抑制病菌的侵染从而表现出对后来相容性晚疫病生理小种的侵染表现出抗性。有毒植物是自然界一类特殊的植物类群，有毒植物之所以在體内产生具有一定毒性的化学成分，是由于植物在长期的进化过程中，要经历较长时间严酷的环境胁迫，为了应对这种不利条件，植物体除了形成植物适应陆生生活所需完善的组织与结构外，在生物化学方面也要出现一些适应性变化，这一变化除了植物产生所必需的代谢产物如糖类、脂类、蛋白质及核酸类之外，还应产生一些所谓的有毒的“次生代谢”产物，以适应生存环境的不断变化。自有生物界以来，生物毒素就已经存在，人类对生物毒素的研究和利用也已有久远历史，其研究发展对于农业、畜牧、医学、药物学、环境、灾害防治等多方面亦有重要意义。植物毒素的研究具有广泛的科学意义和应用价值，其未来发展应给予关注。

现在已知的植物毒素有1000余种，从化学结构上将其分为蛋白毒素和非蛋白毒素两大类，前者为生物大分子，后者是分子量较小的有机化合物。主要包括五大类，即非蛋白质氨基酸、生物碱、蛋白质毒素、不含氮毒素和生氰糖苷类毒素。在植物当中通过生物或非生物胁迫诱导产生的植物毒素种类繁多，在禾本科、豆科、茄科和葡萄科植物中检测到的植物毒素有几种到达几十种之多，且各个科之间的植物毒素种类大都不相同。迄今为止芸薹属中分离出来的植物毒素共有45种，其中大多数都是源自氨基酸（硫）色氨酸（aminoacid（s）tryptophan）的含硫生物碱。植物毒素含量受许多因素的影响，如种间差异、生长阶段、植株部位、自然环境、农药化肥施用情况等，一种植物可以含有多种不同的植物毒素，不同科属的植物也可以含有相同的植物毒素，有的植物全株有毒，有的仅某个或数个部位有毒，有的植物全部发育阶段有毒，有的只在某些发育阶段有毒。芸薹属中已知的通过病原微生物诱导生成的植物毒素有camalexin、4 hydroxyindole3-carbonyl nitrile （4-0HICN）、spirobrassinin、环芸薹宁cyclobra ssinin、rutalexin、rapalexinA、芸薹抗毒素brassilexin、brassinin和erucalexin。以上植物毒素成分仅在白菜型油菜（AA基因组，Brassinin和spirobrassinin）、芥菜（AABB基因组）和拟南芥（camalexin和4-OH ICN）中检测得到。目前国内外对十字花科中植物毒素的研究还很不足，相关报道主要集中在对模式植物拟南芥的研究。虽然芸薹属作物植物毒素有9种，但在拟南芥中的植物毒素一度被认为只有camalexin，RAJNIAK等于2015年在拟南芥中发现一种新的植物毒素4 hydroxyindole3 carbonyl nitrile （4-OHICN）。

已经报道出最新研究出的植物毒素camalexin对拟南芥植物的一些病原体发挥防御功能，在拟南芥根部的积累对根肿菌的侵染表现出明显的抗性，并且抗根肿病基因可以促进camelexin的合成抑制根肿菌的生长。植物在受到病原微生物侵袭时，自身会识别病原微生物从而通过激活ASA、ASB/PAT PAI/IGPS/TSA/TSB CYP450家族相关基因从分支酸（chorismate）经一系列复杂反应合成色氨酸（tryptophan）并最终形成多种植物毒素来抗击来自病原微生物的威胁。国内外对芸薹属中通过病原微生物诱导生成的植物毒素的代谢途径及其调控基因大都还处于未知状态。camalexin和4-0H-ICN这两种植物毒素在拟南芥中的研究最为深入，它们的合成途径共享了由色氨酸合成IAOx的途径，IAOx之后受一对旁系同源基因（CYP71A12/CYP71A13）以及其他C YP家族基因调控最终分别生成camalexin和4-OHICN。camalexin的合成途径除了部分主要调控基因仍有待进一步验证之外都已经清晰明了；4-OH ICN的合成途径及主要调控基因已基本清楚。在色氨酸到camalexin和4-OH-ICN的合成途径当中，在其他基因的调控下还可以经IAOx或者IAN合成吲哚乙酸，也可经由IAOx在CYP8381等基因的作用下合成吲哚类硫苷。由此可见植物次级代谢产物合成途径的复杂性。

试验中高效液相色谱法（HPLC）用于植物毒素的提取，高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法，与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：应用了颗粒极细（一般为10微米以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，分离效率高；采用高压输液泵输送流动相，分析时间短；广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了检测灵敏度。高效液相色谱法自20世纪60年代崛起，经过数十年的发展，在理论和实践方面日趋完善，已经成为一种主流的色谱分析方法。使用高效液相色谱法时需要注意的问题：样品的相对分子质量大或复杂其保留行为对有机溶剂比例的微量变化非常敏感，等度洗脱时分离结果的重现性差，如多肽、蛋白质和低聚物等生物大分子，梯度洗脱是最好的选择；若样品溶解于己烷、庚烷等非极性溶剂时，即为非极性样品，可以考虑使用正相色谱；若样品溶解于二氯甲烷、甲醇、乙腈等极性溶剂时，即为极性样品，考虑的分离模式就是反相色谱；如果样品溶于水，就首先检查水溶液的pH值；当样品中有酸或碱性物质时，较常用的是缓冲盐，其不仅可以控制流动相的pH值，还起到提高保留时间的重现性和改善峰形的作用；当样品中有对映异构体时，就要考虑在流动相中加入手性衍生化试剂或使用手性色谱柱；有机溶剂的种类和配比决定流动相的极性，即洗脱能力，这对出峰时间、峰形、分离度等有着不可忽视的作用；有机溶剂的种类和配比决定流动相的极性，即洗脱能力。这对出峰时间、峰形、分离度等有着不可忽视的作用。

芸薹根肿菌（P.brassicae）专性寄生于芸薹属、萝卜属以及拟南芥等十字花科活体植物的根部，其分类地位尚不清楚，一般认为根肿菌属于原生动物界、丝足虫门、植物寄生黏菌纲、根肿菌目、根肿菌科的一种有害菌，是栽培和野生十字花科感病植物上根肿病的致病性病原菌，病菌通过侵染蔬菜、油菜等十字花科植物根毛导致根部薄壁细胞增生而形成肿瘤，1878年由俄国学者WORONIN首次发现并命名。根肿病（Clubrootdisease）是由芸薹根腫菌（Plasmodiophorabrassicae）侵染引起的一种传染性非常强的土壤病害。当植物根系受到病菌刺激，薄壁细胞大量分裂和增大，植株根组织异常大量增生而形成肿瘤，随着肿根不断膨大，根部维管束组织受损，导管不通畅，不能有效地吸收和运输矿物质和水，导致生理机能受阻。侵染后期，植株地上部分死亡，根系上细胞受到病菌刺激大量分裂增生，肿瘤逐渐粗糙直至表面龟裂，常易受到其他杂菌入侵而造成腐烂，从而导致根系生长和吸收能力受损，病株地上部则表现为生长发育迟缓、叶片失绿变黄、无光泽、植株矮小、不能形成正常器官、萎蔫甚至枯萎死亡等症状，造成品质下降，减产，给生产带来巨大损失。肿瘤形成的部位、大小多与寄主有关，一般白菜、花椰菜、甘蓝等叶菜类蔬菜的根瘤主要发生在主根及侧根上，主根上根肿大但数量少，侧根上根肿数量多但体积小。该病最早发现于地中海西岸和欧洲南部，在欧洲、北美发病已久，后传入韩国、日。现在全世界均有分布，尤以温带地区发生更为严重，目前，根肿病在中国大部分省、市、自治区都有分布，特别是进入21世纪后，根肿病在云南、重庆、四川等地迅速扩大。近年来，面对芸薹种根肿病发病的严重趋势，国内外研究机构在芸薹种抗根肿病基因的挖掘和定位方面取得了很大进展。日本研究者YOSHIKAWA（1993）通过对芸薹种不同亚种包括结球白菜亚种、白菜亚种和芜菁亚种的根肿病抗性鉴定，仅从源于欧洲的芜菁中，发现了抗根肿病遗传资源。此后，世界各地科研人员相继利用这些抗源定位到了一些抗病基因。迄今，从这些抗病资源中共发现和定位了14个CR位点。

芸薹属作物是我国最为重要的蔬菜和油料作物之一，包括大白菜、甘蓝、花椰菜、青梗菜、菜薹等大宗蔬菜，甘蓝型油菜和白菜型油菜等油料作物。常年种植面积3.75亿亩，其中油菜面积1.02亿亩，蔬菜2.73亿亩。但近年来，我国大部分芸薹属作物产区受到根肿病的严重侵染，并有大面积扩散的趋势，尤以芸薹种蔬菜作物大白菜受害最为严重。根肿病现已成为我国芸薹属作物的主要病害之一，在世界各地每年因根肿病的危害导致芸薹属作物减产多达10%～15%，发病严重时可导致作物绝收。

根肿病的防治形势已刻不容缓，但现有的根肿病防治方法仍然有相当的局限性。比如生物防治、化学防治、农业防治措施虽然在一定程度上起到了防治根肿病的作用，但同时存在土壤、环境污染，生产成本高等诸多问题，仍不能从根本上解决大白菜栽培所面临的严重问题。国际上对根肿病的研究，特别是对根肿菌生理小种鉴定一直都非常重视，因为鉴定结果直接关系到抗根肿病品种的有效选育。国内对根肿病的研究基本上侧重于发病规律和防治方面，对病原菌生理小种、发病机理、抗性育种等方面的报道还很少。虽然大白菜抗根肿病育种取得了一定的进展，但也面临着由根肿菌生理小种变化而引起的抗性丧失问题。抗根肿病基因的挖掘和抗病基因的克隆受限于抗源材料的缺乏，相关研究也进展缓慢。从抗病基因的挖掘，利用分子标记辅助选择（MAS）技术，到选育出复合抗病品种的育成才是防控根肿病危害最经济和有效的途径之一。

camalexin对根肿菌侵染具有抗性作用并且抗根肿病基因能够促进camelexin的合成这一发现为芸薹属十字花科作物的抗根肿病研究开辟了一条新的途径，为日后对其他抗根肿病植物毒素的研究打下基础，从而进一步深入研究植物毒素对根肿菌的防御机制、挖掘合成植物毒素的基因及植物毒素合成与抗病基因之间的关系等等，对解决世界芸薹属作物根肿病害问题具有重要意义。