骨骼肌昼夜节律分子钟机制的研究进展

闫银弟 罗旭光 杨艳萍 李海荣 曹锡梅

山西医科大学（太原 030001）

生物体以时间为周期所表现出的规律性的机体活动变化模式称为生物节律，又称近日节律。节律性是从低等的单细胞生物到人类的保守的进化特征［1］，并且参与调控基因的表达［2］。生命活动表现出以24 h为周期的变动称为昼夜节律［3］。已有的研究普遍认为，昼夜节律受控于中枢下丘脑视交叉上核［4］。该节律由分子钟驱动，分子钟存在于生物体几乎所有的细胞，包括核心钟基因BMAL1（brain and muscle ARNT⁃like protein 1）、CLOCK（circadian locomotor output cycles kaput）、Per1/2（period1/2）和 Cry1/2（cryptochrome1/2）。但是关于外周组织昼夜节律的研究相对较少，如骨骼肌和心脏。本文阐述骨骼肌昼夜节律分子钟机制的相关性研究，将有助于进一步研究骨骼肌发育分化，为维持骨骼肌的健康提供一个新思路。

1 昼夜节律的分子钟机制

长期以来，多数学者认为中枢下丘脑视交叉上核的昼夜节律控制着外周组织器官的节律性，如骨骼肌，并使其保持同步［5⁃6］。小鼠眼睛接受光刺激后，通过神经信号传播到中枢视交叉上核，以分层方式同步中枢和外周分子钟［7］。当损毁中枢下丘脑视交叉上核后并不会中断外周组织的昼夜节律，仅使这些组织之间去同步化［8］。已知昼夜节律不仅控制睡眠和清醒状态、胃排空时间，而且还参与调节心情、认知、感觉敏锐度、呼吸节律、体温等。循环系统和免疫系统也会受到昼夜节律的调节，如心率和血压［9］。小鼠肝脏和骨骼肌中的数百种基因具有昼夜节律表达模式［10］。那么中枢昼夜节律和外周组织的功能活动有怎样的联系呢？

哺乳动物中大多数转录因子以时间依赖的方式激活或者抑制表达基因的靶基因，其中BMAL1、CLOCK、Per1/2和Cry1/2转录翻译反馈机制是核心［11］。作为主要的调节子，BMAL1与CLOCK形成二聚体，结合靶基因启动子区的E⁃box（CACGTG）诱导靶基因的表达。如 Period（Per1和Per2）和Cryptochrome（Cry1和Cry2）被BMAL1/CLOCK二聚体激活。反过来Per和Cry形成复合物反馈抑制BMAL1/CLOCK二聚体的活性［4］。分子钟几乎存在于生物体所有的细胞，维持正常的昼夜节律对生物体的生命活动具有十分重要的作用。此外，其他调控回路作为补充，进一步巩固加强分子钟的功能，包括核受体Rev⁃erbα（Nr1d1）、Rev⁃erbβ（Nr1d2）和 RORα（Nr1f1）。BMAL1/CLOCK 二聚体复合物能够直接诱导上述核受体的表达；核受体Rev⁃erbα则竞争BMAL1启动子元件从而控制该基因的节律性表达［12］。缺失 RORα的小鼠表现出异常的昼夜节律［13］。不同的是 Rev⁃erbα/β激活BMAL1的转录而RORα抑制BMAL1的转录［4］。分子钟还能够通过翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、泛素化等作用，进一步调节昼夜节律［14］。酪蛋白激酶（CK1ε）、分裂原蛋白激酶（MAPK）和糖原合成酶激酶（GSK⁃3β）均是分子钟磷酸化作用的组件，通过泛素化作用能够控制转录的激活与抑制［14］。翻译后修饰如组蛋白乙酰化或去乙酰化，控制分子钟方面发挥着重要作用［14］。在小鼠肝脏，组蛋白脱乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）调控靶基因组DNA显示出周期性节律；核受体Rev⁃erbα募集HDAC3定位到靶基因保证肝细胞的正常脂代谢，若敲除 Rev⁃erbα或 HDAC3导致肝脂肪变性［14］；当小鼠缺失Rev⁃erbα基因导致脂质代谢异常，促进饮食诱导的肥胖并改变诱发糖尿病的血糖和血脂利用之间的平衡［15］。当小鼠禁食时，肝脏和脂肪组织的脂质代谢改变，需要与骨骼肌协同工作，才能维持葡萄糖平衡［14］。

2 骨骼肌发育分化中肌调节因子发挥的作用

肌调节因子（myogenic regulatory factors，MRFs）表达于骨骼肌的成肌细胞，是一组具有碱性螺旋⁃环⁃螺旋（basic helix⁃loop⁃helix，bHLH）结构的转录因子，包括MyoD、Myf5、myogenin 及 Myf⁃6［16］。该调节因子均含有 E 蛋白，能够结合目的基因调节区的E⁃box，在成肌细胞的分裂增殖及分化为成熟骨骼肌细胞中起决定作用。基因敲除小鼠显示，Myf5和MyoD在肌发育早期发挥作用，赋予中胚层前体细胞肌源性命运［17］；Myf6在肌发育早期和晚期均发挥作用［18］，并在Myf5：MyoD双敲除小鼠（Myf5：Myod double⁃null mice）肌源性测定和分化中发挥作用［18］。myogenin是骨骼肌形成过程中关键的调节因子，在肌发育晚期发挥作用并呈节律性表达［19］。

骨骼肌细胞的发育分化是多因素参与并受严格调控的复杂生物学过程。蛋白精氨酸甲基转移酶Prmt5发挥作用转录激活基因myogenin启动子区是表达desmin、α⁃骨骼肌肌动蛋白（sketal α⁃actin）和骨骼肌细胞分化所必需的［20］。而desmin等骨骼肌标志性蛋白的表达需要骨骼肌调节因子MyoD的激活［21］，MyoD调节肌细胞的分化又依赖于蛋白精氨酸甲基转移酶Prmt5［20］。为使机体更适应于日常环境的变化，分子钟驱动的昼夜节律接近于24 h，破坏该节律则有害于骨骼肌的健康［8］；如果晚上严格禁食，MyoD和myogenin在骨骼肌的表达显著上调［19］。然而在小鼠胚胎发育晚期（E16.5d到E19.5d），神经支配的伸长肌MyoD和myogenin下调；神经支配的比目鱼肌MyoD下调、myogenin表达水平保持不变［22］。骨骼肌成肌细胞分化过程中许多新基因的有效表达需要myogenin［23］。myogenin基因敲除小鼠的骨骼肌成肌细胞难以分化成正常的肌纤维，并表现为出生后高致死率［24］。可见骨骼肌发育分化过程中肌调节因子是必需的而且其调节具有特殊性。

3 钟基因BMAL1/CLOCK对骨骼肌肌调节因子的调控作用

骨骼肌是人体的主要器官之一，约占体质量的40%，参与维持姿势、运动和呼吸。同时，它也是主要的代谢器官，具有内分泌功能，对胰岛素敏感［4］。胚胎发育过程中骨骼肌开始形成，出生后进一步发育成熟，具有特殊的收缩功能以及新陈代谢功能［4］。成人骨骼肌可以分为快肌纤维和慢肌纤维，慢肌纤维如比目鱼肌和膈肌，含有大量的线粒体，收缩速度慢、收缩力小、持续时间较长，与有氧运动有关；快肌纤维如趾长伸肌，特点与慢肌纤维恰好相反，几乎不含线粒体，收缩速度快、收缩力较大、持续时间较短。然而，骨骼肌纤维类型是在出生以后才建立，并保留可塑性，受外界刺激调节。运动参与调节骨骼肌功能，耐力运动促进向慢肌纤维转换，力量运动则促进向快肌纤维转换。运动还可以控制生物体的能量平衡，影响全身的昼夜节律［25］。提示昼夜节律和骨骼肌健康、正常的功能维持相关。

已知小鼠骨骼肌中至少有215个基因具有昼夜节律表达模式［8，26］，这些基因不仅仅参与构成核心分子钟，如BMAL1、Nr1d1、Nr1d2、Per2，而且还参与骨骼肌的功能和代谢。利用特异性基因缺失小鼠观察核心分子钟基因对骨骼肌的影响：BMAL1⁃/⁃小鼠以及 CLOCKΔ19小鼠寿命显著缩短，提前出现衰老的特征，如肌纤维张力减弱；电镜观察可见肌丝结构紊乱、线粒体体积变小［27］。Rev⁃erbα缺失小鼠表现出运动能力低下，可能与线粒体的发生和活性缺失有关［28］；Per2缺失小鼠的运动耐力和运动能力均降低［4］。特异性诱导小鼠骨骼肌BMAL1缺失导致骨骼肌总重量增加，但是肌力明显减弱，而BMAL1⁃/⁃小鼠骨骼肌的总重量减少［4］。提示钟基因参与影响骨骼肌的代谢和健康。

有研究表明肌调节因子与分子钟基因之间存在联系。野生型小鼠骨骼肌MyoD1的表达呈周期性波动，当突变CLOCK后MyoD1周期性波动消失；若缺失BMAL1，MyoD1的周期性波动也同样消失［29］。BMAL1/CLOCK二聚体能结合到MyoD1启动子，诱导MyoD1周期性波动表达［4］。已知MyoD⁃/⁃小鼠与BMAL1⁃/⁃和CLOCKΔ19小鼠有相似的特点：骨骼肌张力降低、肌丝结构紊乱［26］。BMAL1与CLOCK结合MyoD启动子区域的核心增强子改变MyoD靶基因的表达，表明MyoD是BMAL1与CLOCK的控制基因［4］。然而BMAL1与CLOCK缺失小鼠的骨骼肌形成正常，提示存在补偿机制，如MyoD突变小鼠中观察到肌调节因子Myf5发挥补偿调节作用［30］。观察马和斑马鱼的骨骼肌，可见肌调节因子Myf6与BMAL1、CLOCK表达高峰呈现出同步的昼夜节律［31］，提示肌调节因子受钟基因的调控。BMAL1与CLOCK除参与调控MyoD1的表达，BMAL1还参与Wnt信号通路转录控制肌分化［6］。胚胎发育过程中，Wnt信号通路在骨骼肌分化过程中发挥着重要作用，构成钟基因和肌分化的桥梁［32］。

4 讨论

骨骼肌作为人体的主要器官，其结构和功能变化与疾病的发生发展密切相关，如常见的心血管疾病和癌症都伴随着骨骼肌质量的减轻、肌力减弱和代谢异常［33］。昼夜节律和分子钟机制调节骨骼肌大量基因的表达，其中许多基因还参与转录、肌发生分化和新陈代谢［29］，昼夜节律紊乱可能会损害骨骼肌的健康。正常情况下，骨骼肌和其他组织协同工作，保持一致的昼夜节律。缺失核心钟基因BMAL1导致肌组织严重病变，如肌纤维型转变、肌节结构异常等［14］。肌节是骨骼肌的基本结构和功能单位，位于相邻两条Z线之间的一段肌原纤维，其中Z线是由多种蛋白组成的复杂结构［34］。已知Z线相关蛋白Tcap（Titin cap，telethonin）参与调节正常肌节的发育。Tcap能够与Titin N末端结构域结合，作为Titin激酶的底物，与Titin相互作用保证肌节的完整性［34］。胚胎发育过程中，肌调节因子MyoD、myo⁃genin和Mfy5能够结合到Tcap启动子区域的E⁃box，控制Tcap的表达，影响骨骼肌肌节的结构及完整性［35］。骨骼肌成肌细胞C2C12分化过程中Tcap的表达显著上调，并呈明显的周期性节律，通过RNA干扰（RNA interference）敲低Tcap则抑制C2C12的分化及生长［36］。BMAL1/CLOCK二聚体能够促进Tcap表达，BMAL1/CLOCK二聚体结合MyoD启动子协同增强促进Tcap的表达。胚胎发育过程中Myogenin也参与调节Z线组成蛋白［37］，促进Tcap表达。综上，研究骨骼肌昼夜节律分子钟机制将有助于明确分子钟基因在骨骼肌发育分化过程中的作用及对骨骼肌功能和代谢的影响，为维持骨骼肌的健康提供新思路，对研究因为昼夜节律紊乱引发的疾病也有一定的指导意义。

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