绞股蓝总皂苷对胶质母细胞瘤细胞株U87细胞形态、迁移能力的影响

魏依兰，曲杰，窦志杰，申晓平

(承德医学院附属医院，河北承德 067000)

胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤，恶性程度高。GBM可发生于任何年龄，尤以45～65岁高发，30岁以下罕见，且男性多于女性。GBM病变部位主要位于额颞叶、顶叶和枕叶，小脑和基底节区少见，可同时累及多个脑叶。GBM分化程度差，常为密度较高的多形性细胞，亦有明显的异型性，细胞核分裂活跃。GBM组织病理学特点为明显的假栅栏样坏死和肾小球/花蕾样微血管增生[1～3]。GBM具有很高的浸润性，浸润生长迅速为患者死亡的主要原因之一，其浸润生长能力与肿瘤细胞迁移能力有关。目前，GBM标准的治疗方法为最大范围的手术切除联合术后放化疗，但患者预后较差，且易复发[4]。绞股蓝属于葫芦科落叶草质藤本绞股蓝属植物，主要成分为绞股蓝总皂苷(Gyp)，Gyp具有抗肿瘤、抗氧化、抗心肌缺血缺氧、抗脑缺氧、降血脂、护肝、增强免疫力等功效[5,6]。研究[5,7,8]表明，Gyp与其他中草药配伍可用于治疗肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌等。研究[8]显示，Gyp发挥抗肿瘤的作用是抑制肿瘤细胞的增殖，但关于其抑制肿瘤细胞迁移功能方面的研究鲜有报道。本研究观察了Gyp对GBM细胞株U87细胞形态、迁移能力的影响，并探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1细胞株、药物、试剂、仪器U87细胞由承德医学院附属医院中心实验室提供。绞股蓝干燥全草购自安徽亳州中药材市场，承德医学院中药研究所鉴定为葫芦科绞股蓝属植物干燥全草。RPMI1640培养基干粉、FBS(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，IL-6抗体(PeproTech RD公司)，β-actin抗体(Sigma公司)，辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥公司)，HPD-700树脂(沧州宝恩化工有限公司)。Primo R型低温高速离心机(Heraeus公司)，CO2培养箱(Forma公司)，倒置荧光显微镜(Olympus公司)，HFsafe-1500型生物安全柜(Heal force公司)，Transwell小皿(Millipore公司)，LS-75SI高压消毒锅(Yamato scientificwc公司)，HP-8453紫外-可见分光光度计(惠普公司)，梅特勒-托利多AG245电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，JHBE-50S闪式提取器(河南省金鼐科技发展有限公司)。

1.2Gyp制备取绞股蓝干草粉末20 g，加入10倍量的70%乙醇，用闪式提取器提取2次，第1次用时3 min，第2次用时1 min，合并提取液，抽滤，减压，回收干燥。制备绞股蓝样品液：闪式提取法提取100 g绞股蓝粗粉，合并提取液，减压，回收乙醇至无醇味，加蒸馏水溶解，滤过，定容至200 mL(含Gyp 17.4 mg/mL)。100 mL锥形瓶中加入预处理后的HPD-700树脂3 g，加入25 mL绞股蓝样品液，放入恒温(25 ℃)摇床中振荡24 h(140 r/min)，达到饱和吸附后滤出，收集吸附液。再用75%乙醇液洗脱，树脂吸附容量为122.1 mg/g干树脂[9]。配置10、5 mg/mL的Gyp溶液保存备用。

1.3 U87细胞培养用RPMI1640培养液(含10%胎牛血清及青、链霉素各100 U/mL)培养U87细胞，置于37 ℃、5%CO2环境的培养箱中。于倒置显微镜下观察细胞的生长情况，利用0.25%胰蛋白酶消化传代，收取对数生长期的U87细胞用于以下实验。

1.4U87细胞形态学观察取6孔培养板接种U87细胞悬液，每孔1 mL，分别加入10、5 mg/mL的Gyp溶液各100 μL(分别计为A组和B组)，C组予等量PBS，常规培养细胞。24 h后，用倒置相差显微镜观察培养板中细胞形态。不同浓度下的U87细胞培养均重复3次，留最典型结果作为最终数据。

1.5U87细胞迁移能力观察①采用划痕实验。在6孔培养板中接种U87细胞悬液，分别加入10、5 mg/mL的Gyp溶液100 μL(分别计为A组和B组)，C组予等量PBS，常规培养细胞。待细胞贴壁长满后划痕，用PBS液冲洗1遍，洗去脱落细胞后，更换无胎牛血清的培养基，继续培养细胞。观察和拍照记录0、24 h显微镜下各组划痕空白区的变化，计算细胞移动后覆盖划痕区域的面积。②采用Transwell实验。取对数生长期U87细胞，以胰蛋白酶消化，RPMI1640培养基制备细胞悬液，并行细胞计数。将细胞悬液调整为每100 μL中5×104个U87细胞，再进行铺板。24孔培养板加入含15%胎牛血清的RPMI1640培养基，每孔600 μL。在Transwell小室的上室分别加入100 μL含5×104个U87细胞的悬液，最后上室加入1%的BSA 10 μL，为保持上室内的渗透压，调整BSA最终浓度为0.1%。分别加入10、5 mg/mL的Gyp溶液100 μL(分别计为A组和B组)，C组予等量PBS，常规培养细胞。于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养15 h。取出小室，90%乙醇固定，0.1%结晶紫溶液染色，置于倒置显微镜下观察、拍照，随机选择4个×400倍视野行穿膜U87细胞计数，并计算4个视野中细胞数的平均值。重复3次。

1.6U87细胞IL-6蛋白检测取对数生长期U87细胞，分别加入10、5 mg/mL的Gyp溶液100 μL(分别计为A组和B组)，C组予等量PBS，每组细胞数约5×106个。分别加入细胞裂解液300 μL中，冰上裂解30 min，然后用移液器将裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃环境下以12 000 r/min离心4 min，收集上清液保存于-20 ℃下。BCA法测定蛋白浓度。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)每孔上样蛋白45 μg，80 V电泳30 min，120 V电泳90 min，电泳完毕后，将蛋白转移至PVDF膜，在摇床上用新鲜配制含5%脱脂奶粉的PBST液封闭2 h，加入IL-6抗体(1∶500)和抗β-actin抗体(1∶500)，4 ℃反应过夜。取出PVDF膜，PBST液洗涤3次，每次15 min，辣根过氧化物酶标记的二抗室温封闭1 h，再用PBST液重复洗涤3次，10 min每次，最后用化学发光法检测，X线片记录结果。

1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计数资料比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞形态学比较A组：细胞生长慢、体积小、固缩现象非常明显，细胞贴壁现象接近消失；B组：细胞生长缓慢，体积缩小，胞质固缩，部分细胞甚至破裂死亡，细胞生长总体呈现分散悬浮现象，细胞贴壁现象减弱；C组：细胞生长规则，轮廓清晰，形态饱满，胞体透亮，贴壁生长良好。

2.2各组细胞迁移能力比较A、B、C组细胞迁移覆盖区域占原有划痕区的54.8%、82.4%、98.6%，两两比较，P均<0.05。A、B、C组穿膜细胞个数分别占19.8%、58.9%、100%，两两比较，P均<0.05。

2.3各组IL-6蛋白水平比较A、B、C组IL-6蛋白水平分别为小量、中等量、大量，两两比较，P均<0.05。

3　讨论

胶质瘤是一种起源于神经外胚层的胶质细胞瘤，是神经系统发病率最高的恶性肿瘤。根据2016年世界卫生组织标准将中枢神经系统肿瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中GBM属于Ⅳ级，恶性程度最高，患者中位生存期14～16个月，只有10%的患者确诊后生存期超过36个月[10～12]。尽管目前治疗GBM手术方式的进步使胶质瘤切除更精确，但由于其较强的侵袭能力，导致患者预后极差，超过90%患者在原有癌瘤周边组织复发[13]。因此，降低GBM细胞的迁移能力对患者预后的改善显得尤为重要。

Gyp是葫芦科植物绞股蓝提取出来的主要成分，其抗肿瘤作用备受关注。诸多研究[14]表明，Gyp对人结直肠癌细胞SW-480、人非小细胞肺癌细胞A549、人舌癌细胞SCC4、人肾上腺皮质癌细胞SW-13等迁移能力均有不同程度的抑制作用。而目前，关于Gyp对人GBM U87细胞迁移能力作用的影响鲜有报道。本研究显示，Gyp可抑制U87细胞生长及减弱细胞迁移能力，尤以10 mg/mL的Gyp效果更佳。

多种细胞因子表达水平异常与GBM的迅速浸润生长有关[10,11]，其中促进肿瘤细胞离散和迁移的因子成为国内外专家学者研究的重点[15]。IL-6是由多种细胞分泌的一种多功能糖蛋白。近年大量实验证明，IL-6在众多肿瘤细胞中异常高表达与肿瘤的发病、诊断、治疗及预后相关联[16～19]。IL-6是GBM侵袭迁移的重要调节因子，在其迁移过程中起重要作用。IL-6可以通过影响蛋白酶分泌及细胞骨架重排两方面机制，促进GBM细胞的侵袭、迁移能力[16]。本研究显示，随着Gyp浓度的升高，IL-6蛋白表达水平越低，表示Gyp能降低细胞因子IL-6蛋白表达，从而抑制U87细胞生长及减弱细胞迁移能力。

总之，Gyp可抑制U87细胞生长及减弱细胞迁移能力，其机制可能与其可抑制U87细胞内IL-6蛋白表达水平有关。

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