PCR-RFLP技术与结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术对HBV拉米夫定耐药基因检测效果分析

卜范峰，朱晓艳，彭德志，王睿，田欣欣，王燕，周永坤

(1 济南金域医学检验中心，济南250101；2 山东省疾病预防控制中心；3 山东中医药大学附属医院)

拉米夫定为核苷类似物，是治疗慢性乙肝的常用药物，但治疗6个月以上易出现耐药[1]。DNA聚合酶基因突变是导致HBV耐药的主要原因。其基因突变主要在204位点的YMDD基序，即酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天门冬氨酸(D)-天门冬氨酸(D)中的M分别被缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或色氨酸(S)取代，生成YVDD、YIDD或YSDD；此外，还可出现与180位点的联合突变，180位点的M被亮氨酸(L)取代，生成L180M[2]。目前常用的基因突变检测方法有DNA测序法、寡核苷酸芯片法、实时定量PCR TaqMan探针法等，但均存在不同程度缺陷，如操作繁琐、检测费用高、技术条件要求高等[3]，且均难以检测出混合突变样本。PCR-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术和结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术检测费用低、操作简单，可弥补以上方法的不足。本研究分析PCR-RFLP技术与结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术检测HBV DNA聚合酶基因突变结果，旨在为乙肝患者拉米夫定耐药基因检测提供易于操作且价格低廉的快速、可批量检测方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1～6月济南金域医学检验中心收集的乙肝血清标本186例份。标本来源患者经临床和实验室检查明确诊断，除用拉米夫定治疗外，未用其他抗病毒药物治疗。其中，接受拉米夫定治疗≥6个月者162例、<6个月者19例，未进行任何治疗者5例。

1.2 拉米夫定耐药HBV DNA聚合酶基因突变检测

1.2.1 PCR-RFLP技术 采用聚乙二醇沉淀法[4]提取各血清样本HBV DNA，以提取的HBV DNA为模板进行PCR扩增。参照文献[5]利用Primer Premier5.0软件设计相关引物，并由深圳华大基因股份有限公司合成。引物序列：上游引物F1：5′-CACTGTTTGGCTTTCAGTCAT-3′、F3： 5′-GTGGGCCTCAG-TCCGTTTCTC-3′、S1：5′-CACTGTCTGGCTTTCAGCT-AT-3′，通用下游引物B2：5′-GTTCAAATGTATACCC-AAAG-3′。其中，引物F1和B2用于检测204位点基因突变，引物S1和B2用于检测204位点YSDD基序突变，引物F3和B2用于检测180位点基因突变。PCR反应体系共50 μL：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，5 μmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL Hot-Start Taq酶0.6 μL，HBV DNA 2 μL，ddH2O 32.4 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s、46 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40个循环，最后72 ℃延伸5 min。取PCR产物8 μL，分别用限制性内切酶NdeⅠ、SfcⅠ或NIaⅢ水解，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束，在Alpha ImageTM2200 system成像仪上观察酶切结果并拍照。结果判断：HBV DNA经引物F1和B2扩增后的电泳产物用限制性内切酶NdeⅠ酶切，可被NdeⅠ酶完全切开，即为野生型，酶切后片段大小分别为99、20 bp；可被NdeⅠ酶不完全切开，即为野生与突变混合型；不能被NdeⅠ酶切开，即为突变型。突变型样本可被限制性内切酶NIaⅢ酶进一步切开，即为YVDD突变型，酶切后片段大小分别为97、22 bp；不能被NIaⅢ酶切开，即为YIDD突变型或YSDD突变型。不能被限制性内切酶NIaⅢ酶切开的样本再用引物S1/B2扩增，其产物用限制性内切酶SfcⅠ酶切，可被SfcⅠ酶切开，即为YSDD突变，酶切后片段大小分别为15、105 bp；不能被SfcⅠ酶切开，即为YIDD突变。HBV DNA经引物F3/B2扩增后的电泳产物用限制性内切酶NIaⅢ酶切，可被NIaⅢ酶切开，即为L180M突变型，酶切后片段大小分别为24、167 bp；不能被NIaⅢ酶切开，即为野生型[6]。

1.2.2 结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术 采用聚乙二醇沉淀法[4]提取各血清样本HBV DNA，以提取的HBV DNA为模板进行PCR扩增。所需引物由Primer Premier5.0软件设计，由深圳华大基因股份有限公司合成。引物序列：通用上游引物335u：5′-TCACCAACCTCTTGTCCTCC-3′，下游引物YMDD-L：5′-CCCAATACCACATCATCCAT-3′；YIDD-L：5′-CCCCAATACCACATCATCA-3′；YVD-D-L：5′-CCCAATACCACATCATCCAC-3′；YSDD-L：5′-CCCAATACCACATCATCACT-3′；Control C：5′-CC-CCCAATACCACATCATC-3′；667M：5′-GCACTAGTAAACTGAGCCAT-3′；667W：5′-GCACTAGTAAACTGAGCCAG-3′。其中，上游引物335u和下游引物YMDD-L、YIDD-L、YVDD-L、YSDD-L用于检测204位点基因突变，设其反应分别为反应M、I、V、S；上游引物335u和下游引物667W、667M用于检测180位点基因突变；上游引物335u和下游引物Control C作为阳性对照(即反应C)。PCR反应体系共20 μL：10×PCR buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，400 nmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL Hot Start Taq酶0.2 μL，1×SYBR Green Ⅰ1 μL，10 nmol/L荧光素校准染料1 μL，HBV DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL。反应条件：95 ℃活化Hot Start Taq酶10 min，95 ℃预变性30 s，68～40 ℃退火30 s[7](每个循环降低0.7 ℃)共40个循环，最后72 ℃延伸30 s。记录每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，即Ct值。结果判断：在180位点基因突变检测中，为便于描述，将引物对335u/667M的扩增反应称为反应1，引物对335u/667W的扩增反应称为反应2。反应1用于扩增突变型HBV DNA，反应2用于扩增所有HBV DNA为对照反应。当ΔCt≥4(ΔCt=反应2的Ct值-反应1的Ct值)时，表明被检测样本含有180位点基因突变；当ΔCt<4(ΔCt=反应2的Ct值-反应1的Ct值)时，表明被检测样本180位点存在突变型和野生型；当ΔCt>4(ΔCt=反应1的Ct值-反应2的Ct值)时，表明被检测样本180位点不存在基因突变。在204位点基因突变检测中，反应M、I、V、S分别用于扩增204位点野生型、YIDD突变、YVDD突变和YSDD突变的HBV DNA，反应C作为对照用于扩增所有HBV DNA。当ΔCt≤4(ΔCt=反应M、I、V或S-反应C的Ct值)时，表明被检测样本分别含有204位点野生型、YIDD突变型、YVDD突变型或YSDD突变型HBV DNA。当反应M、I、V或S中，有两个或两个以上的Ct值与反应C的Ct值之差≤4时，表明被检测样本含有204位点混合突变型HBV DNA。

1.3 DNA测序验证 委托深圳华大基因股份有限公司对两种方法获得的PCR产物进行测序，并对测序结果进行比对。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

186例份血清样本中，HBV DNA聚合酶204位点经PCR-RFLP技术、结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术检测及基因测序验证，均检测出野生型HBV 62例(33.3%)；检测出YIDD突变型分别有37(19.89%)、38(20.4%)、44例(23.7%)；检测出YVDD突变型分别有30(16.1%)、31(16.7%)、32例(17.20%)；均未检测到YSDD突变型；检测出YMDD/YIDD混合型分别有13(6.99%)、13(6.99%)、12例(6.45%)；检测出YMDD/YVDD混合型分别有17(9.14%)、16(8.60%)、17例(9.14%)；检测出YIDD/YVDD混合型分别有27(14.52%)、26(13.98%)、19例(10.22%)。PCR-RFLP技术、结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术检测结果与DNA测序验证结果比较差异均无统计学意义(χ2=2.101、1.614，P均>0.05)。

186份血清样本中，HBV DNA聚合酶180位点经PCR-RFLP技术、结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术检测及基因测序验证，均检测出野生型HBV 139例(74.73%)；检测出L180M突变型分别有9(4.84%)、9(4.84%)、9例(4.84%)；检测出L180M+M204I混合型分别有21(11.30%)、20(10.75%)、22例(11.83%)；检测出L180M+M204V混合突变型分别有17(9.14%)、18(9.68%)、16例(8.60%)。PCR-RFLP技术、结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术检测结果与基因测序验证结果比较差异均无统计学意义(χ2=0.054、0.213，P均>0.05)。

3 讨论

核苷酸是合成人体遗传物质DNA或RNA的原料。拉米夫定的化学本质是核苷类似物，其在结构上与核苷酸类似，但并不具有核苷酸的功能。因此，在DNA或RNA合成过程中，核苷类似物可以掺入进去，但却不能合成有正常功能的核酸链，从而终止病毒复制。拉米夫定模拟的是胞嘧啶，其结构与天然人胞嘧啶结构不同，只能作用于病毒。目前认为，拉米夫定抑制HBV复制主要有三种途径：①拉米夫定胞内磷酸化形成的活性三磷酸盐与磷酸脱氧胞嘧啶核苷竞争HBV多聚酶的三磷酸核苷结合部位；②拉米夫定胞内磷酸化形成的活性三磷酸盐导致HBV反转录酶、多聚酶的不可逆性、剂量依赖性抑制；③拉米夫定胞内磷酸化形成的活性三磷酸盐竞争性掺入HBV DNA并导致链终止。但随着拉米夫定用药时间延长，可出现HBV耐药。HBV拉米夫定耐药基因突变与用药时间长短有关，大多数乙肝患者用药超过6个月，即可检测出血清HBV DNA聚合酶204位点YIDD、YVDD、YSDD型基因突变或YMDD/YIDD、YMDD/YVDD、YIDD/YVDD混合突变，180位点L180M型基因突变或L180M+M204I、L180M+M204V混合突变[8,9]。甚至一些未接受任何抗乙肝病毒治疗者也可能会出现类似基因突变[10～12]。不论出现哪种类型的基因突变，继续服用拉米夫定则会出现耐药，患者病情将进一步加重甚至恶化[13]。因此，应用拉米夫定治疗一段时间，必须进行耐药基因突变检测，以指导后续治疗。

PCR-RFLP技术和结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术均是基于PCR扩增原理，与目前常用检测方法比较，其优点为易检测出混合突变样本；不需要购置大型设备，也不需要专门设计探针，对实验室空间和技术人员要求相对较低，检测费用较低。本研究结果显示，两种方法均能检测出204位点和180位点突变及混合突变，且检测结果与DNA测序验证结果比较差异无统计学意义，说明这两种方法均可用于大规模临床检测。但PCR-RFLP技术在PCR扩增后需要对扩增产物进行酶切，然后再电泳，操作相对复杂；而结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术扩增后可直接根据扩增曲线分析结果，不需要再进行其他实验操作，相对更加方便。

HBV拉米夫定耐药基因突变最常见的是YIDD、YVDD及其混合突变。本研究两种方法虽检测出相应的突变类型，但均未检测出YSDD突变，其原因可能是YSDD突变需要较长时间，而本研究患者应用拉米夫定治疗时间较短[14～16]。HBV拉米夫定耐药突变初期，突变病毒株的DNA水平可能较低，DNA测序可能检测不出[6]。本研究两种技术均检测出较低水平的混合突变病毒株。由此推测，在病毒基因突变早期采用这两种方法检测混合突变病毒株，对临床及时更换治疗方案具有重要意义，并可为社会节约大量的医疗资源。

综上所述，PCR-RFLP技术和结合SYBR Green Ⅰ荧光染料的实时荧光PCR技术均可用于HBV拉米夫定耐药基因突变检测。但结合SYBR GreenⅠ荧光染料的实时荧光PCR技术实验方法简便，检测过程快速、准确，检测费用较低，更适合大规模耐药基因突变筛查。

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