高产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及产酶条件优化

姚 瑶,霍元鹏,周 伟,叶佳颖,褚梦真,朱森林,蒋红英

(1.浙江师范大学 地理与环境科学学院,浙江 金华 321004;2.金华职业技术学院 农业与生物工程学院,浙江 金华 321007)

β-葡萄糖苷酶可水解结合在末端的非还原性β-D-葡萄糖苷键,同时释放出葡萄糖体和配基[1],具有良好的增香酿造潜力[2],其在工业化制备、改善饮品风味和酶解工程固化回收处理方面发挥重要的作用。然而天然酶活性较低往往阻滞了其大规模的工业化生产。国内外用于研究的β-葡萄糖苷酶主要来源于微生物,这与来源于植物的β-葡萄糖苷酶活性不高、稳定性差、产量较低有关[3-4]。目前对β-葡萄糖苷酶的微生物来源研究较多[5-6],但不同微生物合成β-葡萄糖苷酶的能力有差异[7]；Wilkowska A等[8]也指出β-葡萄糖苷酶的活力普遍很低,产量不高。因此,寻找一种新的高产β-葡萄糖苷酶的真菌是极其必要的。

目前多数研究的采土样点较为单一,对同一环境中不同地理位置的研究不多。本研究使用七叶苷平板法[9]对不同地区以及不同海拔高度的腐殖质土壤中β-葡萄糖苷酶产生菌进行了筛选,考察了不同生长环境中菌株产酶能力的差异,得到了β-葡萄糖苷酶高产菌,并对其发酵条件进行了优化，得到了利于产酶、成本较低、具有较大利用价值的培养基配方,可为β-葡萄糖苷酶的工业化生产和应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种来源:在金华曹宅山下洪村桔园以及金华北山不同海拔高度处采集长期堆放稻草或覆盖树叶的地下5～25 cm土壤,从中分离筛选产β-葡萄糖苷酶的菌株。初筛培养基为孟加拉红富集培养基[10];复筛培养基为刚果红CMC-Na(羧甲基纤维素钠)琼脂培养基[11];发酵产酶基础培养基的组分为麸皮4.0%、(NH4)2SO40.2%、NH4NO30.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%，pH自然,于121 ℃灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选

1.2.1.1 土样的富集、分离及纯化 取10 g土样置于250 mL装有小玻璃珠的三角瓶中,加入90 mL无菌水,于120 r/min转速下振荡10 min；在无菌环境下取0.1 mL的悬液涂布于孟加拉红培养基中,观察微生物的长势；培养24 h后，从孟加拉红培养基中挑取长势较好的菌株,在羧甲基纤维素钠培养基中进行多次划线分离，直至得到几种不同的纯化菌株。

1.2.1.2 目的菌株的初筛与复筛 将纯化的菌株在28 ℃下培养3 d,向每个平板倒入20 mL刚果红溶液(1 mg/mL),染色30 min后用1 mol/L NaCl溶液进行反复洗涤,测量透明圈和菌落的直径并计算两者的比值；选择两者比值大的菌落直接进行麦麸诱导摇瓶发酵复筛,在28 ℃和转速200 r/min的发酵条件下培养5 d[12]。

1.2.1.3 粗酶液的制备及酶活力的测定 将目的菌株在28 ℃培养5 d后的发酵培养液以13000 r/min离心20 min,收集得到的上清液即为粗酶液。取0.5 mL经过适当倍数稀释的酶液,加入1.5 mL CMC-Na溶液，于40 ℃保温30 min,再加入1.5 mL DNS试剂显色,沸水浴煮沸5 min,冷却后稀释至25 mL,于540 nm处测OD值；以加热灭活(100 ℃,5 min)的酶液按照同样方法作空白处理。在上述条件下定义1 mL酶液1 min水解产生1 μmol葡萄糖的酶活力为一个酶活单位(IU/mL)，其计算公式如下:酶活力(IU/mL)=[葡萄糖含量(mg)×稀释倍数×5.56]/[反应液中酶液加入量(mL)×反应时间(min)]。

1.2.2 产β-葡萄糖苷酶菌株液体发酵条件的优化 分别对两株菌株的培养基成分和培养条件进行优化(表1)。通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定菌株所产β-葡萄糖苷酶的活力，从而确定菌株产酶的最佳条件。

在培养基优化过程中,还需着重考虑培养基所用原材料的来源渠道、价格高低、质量稳定性等因素,将培养基优化至最优条件。

表1 菌株产酶条件优化时相关参数设置

2 结果与分析

2.1 高产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选

2.1.1 高产β-葡萄糖苷酶菌株的初筛和复筛 经过初筛和复筛,有14株菌株在筛选培养基上产生菌落。将这些菌株分别接种于刚果红培养基上培养5 d,利用刚果红染色法[13]筛选得到H2的透明圈直径与菌落直径比值(HC值)最高,H5次之(表2)。用DNS法测定产酶活力，得知H2和H5的初始酶活力居前2位,分别为0.026和0.023 IU/mL,这两个菌株都来源于洪村桔园土壤。因此,本实验选用H2和H5作为进一步发酵培养的研究对象。

2.1.2 目的菌株的鉴定 目的菌株在PDA培养基上培养,生长很快,菌落起初为白色,圆形,背面褐色,培养5～7 d后直径可达2.5～2.8 cm。菌株在分离纯化培养皿上菌丝体产生大量长短不一的分生孢子梗,分生孢子梗顶端膨大，形成近球型顶囊,分生孢子头黑色、球形,有多分支的有隔菌丝。分生孢子壁光滑,菌丝体透明(图1～图2)。根据菌落形态和菌丝观察,菌株H2和H5与标准黑曲霉菌株极为相似,可将这2个菌株初步鉴定为曲霉菌属黑曲霉(Aspergillusniger)。

2.2 产β-葡萄糖苷酶菌株液体发酵条件的优化结果及分析

2.2.1 培养基成分的优化

2.2.1.1 碳源对产酶活力的影响 H2和H5经培养5 d后，酶活力分别达到2.65和2.26 IU/mL,较初始酶活力分别提高了100.9%和97.3%。对于H2菌株，碳源为蔗糖时酶活力最高,其次则是红糖(图3)，这可能与碳源中可生成还原糖的物质总量有关,因为红糖中还原糖含量略少于蔗糖。对于H5菌株,红糖和蔗糖作碳源效果都比较好,红糖作为碳源时酶活力更高。因此,H2以蔗糖作为产酶时最佳碳源,H5则用红糖作为最佳碳源。

图1 菌株H2的菌落形态及在显微镜下的形态

图2 菌株H5的菌落形态及在显微镜下的形态

表2 目的菌株的菌落直径、透明圈直径及其比值和酶活力

2.2.1.2 氮源对产酶活力的影响 从图4可以看出：当氮源为硫酸铵+尿素(1∶1)时,H2菌株所产β-葡萄糖苷酶的活力最大,为6.36 IU/mL,酶活力在最佳碳源的基础上又提高了140%；H5的最佳氮源为硫酸铵+硝酸铵(1∶1),其酶活力又提高了196%。在所有供试氮源的条件下,H2的产酶活力均在3.50 IU/mL至4.66 IU/mL之间；除以硫酸铵+尿素(1∶1)、硫酸铵为氮源时H5的产酶活力在2 IU/mL以下外,其余也都达到3.5 IU/mL以上,优化效果较为明显。因此氮源种类对于菌株所产β-葡萄糖苷酶活力的影响十分明显,H2的最佳氮源为硫酸铵+尿素(1∶1),H5的最佳氮源为硫酸铵+硝酸铵(1∶1)。

图3 碳源对H2和H5菌株产β-葡萄糖苷酶活力的影响

2.2.2 培养条件的优化

2.2.2.1 培养时间对产酶活力的影响 H2和H5所产β-葡萄糖苷酶的活力随着培养时间的增加而增加,在培养5 d时酶活力均达到最大，分别达到0.85和0.82 IU/mL,分别比初始酶活力增加了192%和113%；在培养5 d之后酶活力逐渐下降(图5)。因此,本实验以5 d为培养时间对产酶条件进行进一步优化。

图4 氮源对H2和H5菌株产β-葡萄糖苷酶活力的影响

图5 培养时间对H2和H5菌株产β-葡萄糖苷酶活力的影响

2.2.2.2 培养温度对产酶活力的影响 培养温度对H2和H5产β-葡萄糖苷酶活力的影响趋势几乎相同,在28 ℃下所产β-葡萄糖苷酶的活力均最高(图6)。

2.2.2.3 pH值对产酶活力的影响 当pH值为4.0和4.5时,H2和H5分别显示最高酶活力1.10和0.82 IU/mL(图7)。该结果与Ruchi[3]和Paula等[5]的研究结果“产β-葡萄糖苷酶菌株培养基的最适起始pH值介于4.0～5.0”一致。液体发酵培养基呈酸性,菌株从该培养基中复筛得到,因而也适应酸性环境。

3 讨论

本次实验发现：在北山采集的腐殖质土壤中大量存在产β-葡萄糖苷酶的菌株,并且只要采用适当的纯化及筛选方法即可得到产β-葡萄糖苷酶的菌株；而桔园土壤由于受到人工施肥等因素的影响，从中筛选得到的产酶菌株种类少,这也说明β-葡萄糖苷酶高产菌的研究充满很多可能性。从腐殖质土壤中筛选出来的菌株初始所产β-葡萄糖苷酶的活力比较低,一般都需要经过发酵条件的优化来初步提高其产β-葡萄糖苷酶的活力。

图7 pH值对H2和H5菌株产β-葡萄糖苷酶活力的影响

本实验结果显示，对于筛选出的两株产β-葡萄糖苷酶的菌株H2和H5,当碳源为蔗糖,氮源为硫酸铵+尿素(1∶1),培养时间为5 d，培养温度为28 ℃,pH值为4.0或4.5时,其所产β-葡萄糖苷酶的活力最大。当然不同因素对菌株所产β-葡萄糖苷酶活力的影响程度不尽相同,例如在本次实验中,培养温度对酶活力的影响最大，碳源种类、氮源种类、培养时间次之，这与刘小杰等的优化分析结果[14]一致。而由于大多数酶在酸性范围内都具有较好的稳定性,烟曲霉的相对活性在pH 3.0～6.0内都很稳定[16]，故本实验对pH值的优化效果不太明显。因此,在实际应用中,应选择最适的培养温度为主要优化手段,这样可以最大程度地提高β-葡萄糖苷酶的产量。当然,其他发酵条件的优化也较重要。若能将发酵工艺条件进一步优化,则有望实现工业化生产。

4 结论

利用羧甲基纤维素钠培养基,采用刚果红染色法,并进一步利用液体发酵培养基筛选得到黑曲霉2株。

H2菌株的最适产酶条件:液体发酵培养基配方为4 g/L蔗糖、0.4 g/L 1∶1混合的硫酸铵与尿素、0.3 g/L MgSO4、0.3 g/L CaCl2、4 g/L KH2PO4,初始pH 4.0。H5发酵培养基则以红糖为最佳碳源，以硫酸铵+硝酸铵(1∶1)为最佳氮源,最佳初始pH值为4.5。在28 ℃下，发酵培养到第5天时, H2和H5菌株所产β-葡萄糖苷酶的活力均最大，分别达到6.36和6.70 IU/mL。

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