半微量蒸馏法测定饲料中粗蛋白质含量要点

田 蕴，王益军，葛 敏，贺 燕，张苏珍，徐颢玮，陶 威

（连云港市畜产品质量监督检验测试中心，江苏 连云港 222001）

蛋白质由多种氨基酸组成，是构成细胞、血液、骨骼、肌肉、乳、毛及各种器官组织的主要成分，对生长、发育、繁殖及各器官的修补都是必需的，是生命活动必需的基础养分。粗蛋白质是含氮物质的总称，包括真蛋白质和含氮物，粗蛋白质是鉴定饲料质量时必检的常规营养指标之一，国标GB/T 6432-1994 中采用的是凯氏定氮法，该标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料，其原理是样品在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵，然后加入强碱进行蒸馏，使氨逸出，用硼酸吸收后再用盐酸标准溶液滴定，测出氮含量，从而计算出样品中粗蛋白质的含量[1-4]。其操作程序比较复杂，影响因素很多，本文结合实践经验以半微量蒸馏法为例，从取样开始，对每个过程进行详细解析，指出关键影响因素及解决办法，从而保证检测结果的准确性。

1 试样的选取和制备

1.1 要求

选取有代表性的试样用四分法缩减至200 g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。

1.2 影响因素

1.2.1 采样人员

采样应该由受过适当培训并有饲料采样经验的人员执行，采样应做到随机、客观，避免人为和主观因素的影响，代表性采样的目的是从一批产品中获得小部分样品，而测定这小部分样品的任何特性均可代表该批产品的平均值。

1.2.2 样品量

要得到能代表整个批次产品的样品，就必须设置足够的分样数量，根据批次产品数量和实际采样的特点确定需采的份样数量和重量，重量应≥2 kg。

1.2.3 分样

将各个取样点采集的样品置于干净、平整的铁板上，堆成圆锥形，用干净的样铲将样品转堆混匀；转堆操作时，样品不得从样铲侧面下落，必须做到样品自圆锥顶尖落下，均匀地沿锥尖散落，注意不能使圆锥顶尖错位；如此反复转堆3次，使试样充分混匀，然后把圆锥顶尖压平，用样铲自上压下，把样品分成大致相等的4 个等分，取任意两个对角的等分，其余舍弃，重复操作至得到规定的样品量。

1.2.4 样品粉碎

一般饲料的样品颗粒较大，成分复杂，检测时称样量小，如果细度不够，容易造成称样时样品不均匀，从而引起检测结果的误差。过筛时，要注意把粉碎的试样及粉碎机中残留的部分清扫后充分混匀过筛；同时还要注意，在粉碎或过筛过程中有些样品容易产生自动分级，如玉米，其硬质部分常聚集在上面，软质部分聚在下面，因此粉碎过筛后要重新混合均匀，以减少测量误差[5]。

1.2.5 样品保存

过筛后的样品，要根据样品的特性选择合适的容器密封保存。

2 称 样

2.1 要求

国标中规定称样量为0.5～1 g（精确到0.000 1 g）。

2.2 影响因素

2.2.1 称样的准确性

用分析天平准确称取试样，精确到0.000 1 g，一式两份做平行样。

2.2.2 称样量大小

称取样品的数量要合适，不能太多也不能太少，一般饲料的称样量为0.5 g，粗蛋白质含量≤10%时，称样量＞0.5 g，这样可以避免在滴定时消耗盐酸标准溶液体积过小，减小误差，确保检测结果的准确性。

3 消 煮

3.1 要求

称取试样后，加入混合催化剂6.4 g，与试样混合均匀，再加入硫酸12 mL 和玻璃珠2 粒，置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360～410 ℃）直到呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2 h。消化过程发生以下化学反应：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O。

3.2 影响因素

3.2.1 催化剂

催化剂的作用是提高硫酸的沸点，加快有机物分解。催化剂用量减小，则有机物分解速度缓慢，消化容易不完全；催化剂用量加大，易引起消煮液结晶，造成氮的损失。

3.2.2 硫酸

浓硫酸的作用是对样品进行脱水及碳化。浓硫酸加量不足，容易出现烧干现象，标准中的硫酸用量，可满足大部分样品的消解，对于体积大、重量轻的粗饲料、高蛋白饲料或含水量较高的试样，应适当加大浓硫酸用量，约15 mL，但要注意在后续蒸馏步骤，氢氧化钠的用量也要相应调整[6]。

3.2.3 消化温度和速度

消化时速度要缓慢，如果升温过快，则部分含氮物质来不及转化成硫酸铵，而以气体形式损失掉，会造成检测结果偏低。开始时小火（200～300 ℃）加热，目的是防止沸腾的液体溢出瓶口或将碳化后的黑色颗粒溅到瓶壁上，导致消化不完全，引起结果偏低，在消化过程中可以小心轻摇液体将黑色颗粒冲到瓶底的硫酸溶液中（小心防烫），以避免消化不完全。

3.2.4 消解时间

消解时间对饲料中粗蛋白测定结果影响很大，消解时间太短，消化不完全，消解时间过长，又会造成氨的损失，都会造成结果偏低，通常一般样品在消煮液变绿后至少再消化2 h。

4 消煮液的转移

4.1 要求

将试样消煮液冷却，加入蒸馏水20 mL，转入100 mL 容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。

4.2 影响因素

4.2.1 消煮液冷却时间

一般是等冷却至不烫手时再进行转移，冷却温度不够时，加入蒸馏水，与热硫酸发生剧烈反应，易引起烫伤；冷却时间太长，则消煮液容易结晶，如果出现结晶，可放于电炉上加热溶解，或放在50 ℃水浴中超声溶解[7]。也可定容至200 mL 容量瓶中，计算结果时试样分解液总体积以200 mL计，不影响测定结果[8]。

4.2.2 转移方法

为了防止消煮液损失，可以在容量瓶上加上漏斗，并用玻璃棒引流，小心地将凯氏烧瓶里的液体转移至容量瓶中，并按照少量多次原则，用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶，全部转移至容量瓶中，转移不完全会造成结果偏低。

4.2.3 定容

由于硫酸与水反应会放热，一定要等到容量瓶中液体冷却至室温后再定容，否则会引起定容体积不准确，造成检测结果不准确。

5 蒸 馏

蒸馏过程发生如下化学反应：2NaOH+（NH4）2SO4=2NH3↑+Na2SO4+2H2O。

5.1 要求

将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20 mL 硼酸吸收液和2 滴混合指示剂（甲基红-溴甲酚绿混合指示剂）的锥形瓶中，蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则应补加硫酸。准确移取试样分解液10～20 mL 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10 mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4 min 降下锥形瓶，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1 min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗涤液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

5.2 影响因素

5.2.1 冷凝水

冷凝水要在蒸馏开始前开启，冷却不完全，易造成结果偏低。

5.2.2 系统密闭性

蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，不能漏气，否则易造成氨气逸出，影响检测结果。一般要注意以下几点：蒸馏前应检查定氮仪各导管间的连接处是否密闭并用硫酸铵进行检验；往蒸馏室加样液之前要把冷凝管末端浸入硼酸吸收液液面以下；样液加入蒸馏装置后，要及时水封；加碱液时，碱液尚未流完时，加适量蒸馏水冲洗，并留下少量蒸馏水作水封；整个反应室除了冷凝管路浸在吸收液里，其余管路都保持密封，防止漏气；防止生成的氨气挥发[9-10]。

5.2.3 蒸汽中氮元素的控制

为了防止水中的氮元素随着水蒸汽挥发出来，影响测定结果，在蒸汽发生器里加硫酸，使水中的氮元素转化成硫酸铵[11-12]。

5.2.4 蒸汽量大小

蒸汽量太大，反应室的液体易冲进冷凝管内，引起结果偏高；蒸汽量太小，蒸馏速度慢，容易发生倒吸，引起结果偏低。

5.2.5 反应室溶液体积

在冲洗加样时用水量要少，否则反应室溶液体积太大，液面升高，反应室的液体容易冲进冷凝管内，引起结果偏高。

5.2.6 蒸馏时间

蒸馏时间不够，氨气未完全蒸馏出来，蛋白质含量偏低；蒸馏时间过长，则会造成时间和资源的浪费，如果样品含氮量特别高，可以适当延长蒸馏时间。

5.2.7 清洗

每次蒸馏完毕后应先取下接收瓶，再进行清洗，必须彻底清洗蒸馏室，以免再次使用时影响测定结果。

6 滴 定

6.1 要求

蒸馏后的吸收液立即用0.1 或0.02 mol·L-1盐酸标准溶液测定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。滴定过程发生如下化学反应：NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3

6.2 影响因素

6.2.1 盐酸标准溶液

标准溶液要按照GB/T 601 配制并标定，在使用前应摇匀。

6.2.2 滴定过程

滴定前要注意排除滴定管底部的气泡，过程中要边滴定边摇动锥形瓶，防止来不及反应，滴定速度保持6～8 mL·min-1，和标定时的滴定速度保持一致。

6.2.3 测定终点的判定

甲基红-溴甲酚绿指示剂变色范围为pH 5.0～5.2，pH＜5.0 为暗红色，pH 5.1 为灰绿色，pH＞5.2为绿色，滴定接近终点时要缓慢加入，仔细观察溶液颜色的变化，液体颜色变为无色时接近滴定终点，然后再半滴半滴加入，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点，保持颜色变化和空白测定颜色一致。

7 空白测定

空白检测的目的是校正所用试剂带来的误差。

7.1 要求

称取蔗糖0.5 g，代替试样，按照样品测定步骤同法操作，消耗0.1 mol·L-1盐酸标准溶液的体积≤0.2 mL，消耗0.02 mol·L-1盐酸标准溶液的体积≤0.3 mL。一般做一组平行进行检测，这样可以减小试验测定值与真实值之间的误差，同时也可以衡量整个试验操作过程是否正确。

7.2 影响因素

蔗糖是一种有机物，但是又不含氮，所以能被用来代替样品测试空白，空白样品滴定消耗盐酸的量以0.05～0.15 mL为宜，空白值过高的一般是由蒸馏水的纯度不够、所用试剂的纯度不够及所用器皿清洁度不够等原因造成。

8 蒸馏步骤的检验

8.1 要求

精确称取0.2 g 硫酸铵代替试样按照蒸馏步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。

8.2 影响因素

在保证加碱、蒸馏和滴定步骤操作正确的前提下，系统的气密性是关键影响因素，因此硫酸铵的测定目的通常是为了检查半微量蒸馏装置的气密性。

9 结果计算

先测出饲料中的含氮量，再根据蛋白质的含氮量计算出粗蛋白质的含量，由于一般蛋白质中含氮量约为16%，所以一般用系数6.25 作为氮换算成蛋白质的平均系数。如果饲料中的含氮量已经确定，可用实际系数来换算，例如荞麦、玉米用系数6.00，大豆、小麦用系数5.70[5]。