循环血液中非编码RNA的检测在膀胱癌中的研究进展

巩宇航 丁明霞

昆明医科大学第二附属医院泌尿外科/云南省泌尿外科研究所（昆明 650101）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是世界第九大最常见恶性肿瘤。目前对于BC的筛查，主要是上尿路造影、尿细胞学检测、CT和膀胱镜检查。膀胱镜检查是一种对患者伤害较大的方式，而尿细胞学检查不够敏感并且依赖于操作。由于血清和血浆相对容易获得，循环生物标记是最有前途的诊断手段之一。最近几年发现，一部分非编码RNA可以在循环血液中被检测到，并与BC的发展相关，如：microRNA、lncRNA［1-3］。血液中的 RNA 一部分在有核细胞内，另一部分在无核细胞内即非细胞RNA，这些非细胞RNA通过膜泡结构（凋亡小体，微泡，外泌体）以及非细胞核糖核蛋白在血液中循环。外周血或血浆/血清等血液组分中RNA的特异性改变可能是反应机体不同细胞和组织中生理和病理过程的指标［4-5］。本文讨论BC中涉及的异常的循环血液中非编码RNA，及其在BC诊断中的应用和研究进展。

1 非编码RNA

RNA的转录产物包括信使RNA和非编码RNA，非编码RNA顾名思义即不编码蛋白质的RNA转录产物，非编码RNA被分为两个主要类别：短链非编码RNA（＜200 bp）和长链非编码RNA（lncRNAs，＞ 200 bp）。mircoRNAs是短链非编码RNA（ncRNA）序列，长度为20-22 bp，在健康和疾病方面都具有重要的调节功能。lncRNAs由RNA聚合酶II转录，经多聚腺苷酸化，并进行了剪接，人体外周血中的RNA包含存在于细胞内与细胞外膜性小泡、细胞微泡和外泌体以及无细胞的核糖核蛋白中的，外周血中的循环mRNA与非编码RNA被内化而具有调节受体细胞中重要途径的能力［6］。

外泌体是由30～120 nm的小细胞衍生的囊泡，存在于许多生物的体液中。在20世纪80年代中期由JOHNSTONE小组首次发现［7］，肿瘤细胞外泌体作为信号转运体，通过水平转移生物活性因子，如蛋白质、RNA和DNA，调节局部和全身的肿瘤微环境［8］。值得注意的是，据报道RNA是肿瘤细胞衍生外泌体的主要分子货物，并且许多种类的非编码RNA包括microRNA、环状RNA和长链非编码RNA也在这些外泌体中，可以反映出失调的ncRNA在肿瘤细胞特异表达［9-10］。外泌体ncRNA可以进入血液或其他体液，而这些血浆/血清衍生的或以尿为源的外泌体ncRNA可作为人类癌症早期诊断或预后的重要非侵袭性生物标志物［11］。

2 microRNA在循环血液中检测膀胱癌的可行性

2.1 microRNA在循环血液中的功能及其机制短链非编码RNA（sncRNA）在人类和哺乳动物的血液中循环，其中最丰富的类型之一是mircoRNA并且只有mircoRNA的功能够被良好的描述。在组织和体液中发现不同表达的mircoRNA已经变得越来越重要。肿瘤特异性的mircoRNA首先在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清中发现，高水平的miR-21与改善无复发生存率相关［12］。MITCHELL等［13］对前列腺癌患者的miR-141的研究表明，mircoRNA在人类血浆中不受内源性RNase活性的影响，以一种非常稳定的形式存在。肿瘤表达的mircoRNA的血清水平可以从健康控制群中区分出患有癌症的病人，且具有很高的特异性和敏感性。LU等［16］研究证明了检测人类癌症组织中mircoRNA表达的可行性和实用性。他们发现，不同癌症中，mircoRNA表达的多样性非常高，并发现了大约200个mircoRNA足以对人类癌症进行分类［14］。TAM等［15］研究发现由于mircoRNA是基因调控网络中的管理者，它们与其他生物标记是不同的，因为它们在疾病过程中具有致病作用，而且不是疾病的副产品。mircoRNA参与BC进展的一个可能的机制是，细胞可能会将含有mircoRNA的复合物释放到血液、唾液、尿液和母乳等生物体液中［16］。这些复合物包括mircoRNA结合蛋白，如阿尔古蛋白（AGO）［17］和高密度脂蛋白（HDL）［18］，或包含mircoRNA的微泡［16］。当血液循环时，它们可能会被远端细胞所接收，mircoRNA与Ago2结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），以完全或不完全的配对方式与目标mRNA的3′未翻译区域（3′UTR）结合，如果是完全配对目标mRNA会被核酸内切酶定位切开，如果是不完全配对目标mRNA会被导向翻译抑制［19］。根据生物信息学的预测结果，可能有超过60%的蛋白质编码基因受到microRNA的调控［20］。mircoRNA参与人体稳态的维护，mircoRNA的异常表达与多种疾病有关，包括癌症。microRNA已经被证明可以稳定的存在于癌症患者的血液中［21］，LODES等［22］的研究证明，一毫升血清中即有足够的mircoRNA来检测mircoRNA的表达模式，而不需要扩增技术，并且，还可以通过使用这些表达模式来正确区分正常和癌症患者的样本。综上所述，循环血液中的mircoRNA作为癌症的生物标记是很有潜力的，因为这意味着一种非侵入性的、精确的癌症检测方法。

另外，也有研究发现mircoRNA存在于外泌体中，并与某些疾病有关。有研究指出，循环外泌体的mircoRNA的含量与它们的原发癌细胞相似，这表明外泌体mircoRNA具有用于癌症诊断的潜力［23］。

2.2 循环血液中的microRNA与膀胱癌越来越多的证据表明，mircoRNA作为新的生物诊断标志物具有很大的临床应用潜力，然而在尿液样本中检测单个mircoRNA并不会优于目前的尿路细胞学测试，因为这种分析特异性较低［24］。因此，也许microRNA在循环血液中的检测BC是更好的选择。

2.2.1 miR-26b-5p和miR-144-5p与膀胱癌TOLLE等［25］使用Sanger数据库v14中由754个人类microRNA组成的mircoRNA微阵列，分析了从4个控制群和患有浅表性和侵袭性膀胱癌患者中获得的血液和尿液样本。使用RTqPCR技术，6种不同表达的microRNA在对照组（20个血液，19个尿液样本）和浅表性（18个血液，16个尿液样本）或侵袭性（20个血液和尿液样本）肿瘤的患者中得到验证。在血液中miR-26b-5p检测膀胱癌有94%的特异性和65%的敏感性，因此miR-26b-5p能够在血液中被检测作为BC的标志物。并发现血液样本中侵袭性BC的新标志物miR-144-5p。

2.2.2 miR-92a，miR-100和miR-143与膀胱癌MOTAWI等［26］收集了70个BC患者的的血样和62个对照组血样。用定量实时PCR方法测出三个目标mircoRNA（miR-92a、miR-100和miR-143）的表达，其结果与临床病理资料相关联，并进行了分析，在BC患者中，miR-92a、miR-100和miR-143的血浆水平明显低于对照组，miR-92a的灵敏度和特异性值分别为97%和76%，其截止值为0 573；miR-100的敏感性和特异性值分别为90%和66%，其截止值为0 644；miR-143的灵敏度和特异性值分别为78%和93%，其截止值为0.164；这些发现表明，血浆miR-92a、miR-100和miR-143在临床检测中可能是一种新的循环生物标志物。

2.2.3 miR-497和miR-663b与膀胱癌DU等［27］通过TLDA技术从BC患者和无癌症对照组的全基因组血浆mircoRNA中筛选出8种不同表达的血浆mircoRNA，再通过两个阶段的验证确定了血浆miR-497和miR-663b。前者在血浆中显著减少，而后者则增加。此外通过分析进行评估表明，血浆miR-497和miR-663b具有相对较高的敏感性和特异性。这表明，miR-497和miR-663b可能是BC诊断的一种很有前途的非侵入生物标记物，这是第一个系统地探索特定血浆microRNA的存在，作为中国人口中BC的早期诊断生物标志物。

2.2.4 miR-152，miR-148b-3p，miR-3187-3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p与膀胱癌JIANG等［28］在0.899的接收操作特征曲线下，采用多变量logistic回归模型，建立了6个可能用于诊断BC的mircoRNA实验对象（miR-152，miR-148b-3p，miR-3187-3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p）。这组mircoRNA对于Ta、T1、T2-T4对应的敏感性分别为90.00、84.85和89.36%，显著高于尿细胞学的13.33、30.30、44.68%。此外，Kaplan-Meier分析显示，具有高miR-152表达水平和低miR-3187-3p表达水平的NMIBC的无复发生存率更低。在多变量Cox回归分析中，miR-152与NMIBC的肿瘤复发独立相关。结果表明，血清mircoRNA在诊断BC时可能具有重要的临床价值，此外血清miR-152的表达水平可以提供关于NMIBC复发风险的信息。

3 lncRNAs在循环血液中检测膀胱癌的可行性

3.1 lncRNAs在循环血液中的功能及其作用机制长链非编码RNA（lncRNAs）被定义为一种具有低蛋白编码能力的转录体，它通过调节数个信号通路，在肿瘤发生过程中发挥肿瘤促进或肿瘤抑制作用。异常表达的长链非编码RNA可在循环癌细胞和癌症患者的血清和尿液中检测到，并且它们在癌症的不同阶段和各种组织中表现出特定的表达模式，因此长链非编码RNA可以作为癌症检测的有效生物［29］。另外，一些研究表明特定的外泌体lncRNAs的表达与癌症的临床病理特征相关，这可能是血液中的LncRNAs作为膀胱癌生物标志物的重要机制［30］。

3.2 循环血液中的lncRNAs与膀胱癌

3.2.1 UCA1与膀胱癌人类尿路上皮癌相关因子1（UCA1）基因位于染色体19p13.12，有三个外显子，并编码两个转录产物。肿瘤内缺氧被广泛认为是实体肿瘤最基本的微环境应力之一，不利于肿瘤的快速扩张。在这种严酷的微环境中，肿瘤细胞重塑周围的微环境，不仅是为了维持生存和最佳生长，而且也促进了其随后的入侵和传播［31］。为了适应缺氧微环境，肿瘤细胞也可以刺激外泌体分泌或调节外泌体的含量，从而加速肿瘤转移到更适宜的环境［32］。XUE等［33］研究发现缺氧的肿瘤细胞外泌体能够分泌UCA1在血清中进而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和入侵。另外，不仅在膀胱癌细胞中，在膀胱癌细胞衍生的外泌体中，缺氧都能够诱导了lncRNA-UCA1上调。这表明低氧介导的lncRNA-UCA1转移到膀胱癌外泌体中的机制可能依赖于缺氧诱导的细胞内lncRNA-UCA1的上调。因此，证明缺氧可以调节膀胱癌衍生外泌体的内容物的含量。外泌体为lncRNA-UCA1提供了一种保护膜，以对抗RNase降解，这保证了UCA1能够在血浆、血清、尿液和其他体液中被检测到。他们的实验结果也与这些相一致，与正常的受试者相比，膀胱癌患者血清中的外泌体lncRNA-UCA1水平更高。因此UCA1很可能成为BC潜在的的诊断生物标志物。在有侵袭性和晚期膀胱癌的患者中，化疗是一种合理的选择。然而，膀胱癌细胞往往会对这些疗法产生耐药性，约50%的晚期膀胱癌患者对化疗没有反应。一些研究表明，lncRNA参与了化疗抵抗的发展。FAN等［34］研究发现UCA1的水平在顺铂治疗后的膀胱癌患者血液中显著上调。其机制可能是上调的UCA1增加Wnt6表达并激活Wnt信号，导致顺铂受到抵抗。最终证明UCA1增加了膀胱癌细胞的顺铂耐药，从而成为克服膀胱癌化疗耐药的潜在靶点。

3.2.2 MEG3、SNHG16和MALAT1与膀胱癌DUAN等［35］研究了80名BC患者13个候选LncRNAs的表达并通过定量的实时PCR与邻近的正常组织相匹配。然后分析了240个血清样本（训练集）和3个lncRNAs（MEG3、SNHG16和MALAT1）的差异表达。利用训练集建立了一个逻辑回归模型，并在一个独立的200个血清样本（验证集）中进行验证。由于在恶性肿瘤的起始和发展过程中复杂的发病机制，单一的lncRNA作为生物标志物对于及时发现肿瘤可能不够可靠。他们在血清中建立一个lncRNA小组（MEG3、SNHG16和MALAT1）以改善肿瘤的诊断性能。通过ROC分析，以评估lncRNA小组的诊断性能，结果表明循环的lncRNA小组可以区分BC患者和对照组，并且具有比尿细胞学更好的诊断性能。lncRNA小组对检测Ta和T1肿瘤的敏感度也较高，分别显示了73.1%和80.0%的检测灵敏度，而尿液细胞学的检测灵敏度仅为11.5%和22.9%。这些结果表明，lncRNA小组可能是对BC诊断的潜在的侵入性最小的生物标记，特别是在早期阶段。此外，在这三种lncRNAs中，通过Kaplan-Meier分析确定了血清MEG3的表达减少明显与NMIBC的RFS较差有关。此外，还通过单变量和多变量分析确认血清MEG3是在NMIBC的RFS的独立风险因素。这些结果表明，MEG3是NMIBC复发的独立预测因子。KOHLS等［36］也对血清中MALAT1对于膀胱癌检测的可行性进行了研究，他们通过实时PCR的方法对MALAT1进行了定量分析。结果表明，尽管MALAT1的水平经常略高于检测极限，但无细胞血清RNA的量化是可行的。但与非恶性疾病患者相比，膀胱癌患者的血清MALAT1水平并没有显著增加。

4 结语与展望

迄今为止，固然肿瘤相关ncRNA进入入人体外周血形成循环血液中的RNA以及它们在血液中的存在形式还未彻底确定，但循环血液中的ncRNA在临床上的利用价值正在逐渐被人们所认识。随着越来越多的对这一领域感兴趣的研究者投身到ncRNA与BC的研究领域中，各种非编码RNA作用机制的多样和庞杂逐渐浮出水面，因此现在对于ncRNA功能的认识仍然只是九牛一毛。非编码RNA不仅可以在细胞内发挥作用，在身体的其他部位也可以，这成为目前研究的另一个途径即血清、血浆和其他体液中循环的非编码RNA。非编码RNA在血液中的存在可能是癌症中非侵入性生物标记的金矿。