卵巢上皮性癌组织中HK-Ⅱ、PKB蛋白的表达及其意义

姚俊阁，李冰熠，岳青芬

(郑州大学附属洛阳中心医院妇科，河南 洛阳 471000)

卵巢上皮性癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，5年生存率仅为20%～30%，其病因及发病机制尚不明确，至今还缺少有效的早期诊断方法。因此，深入研究卵巢上皮性癌的发生发展的分子机制对寻找新的肿瘤标记物和治疗靶点具有重要意义。异常活跃的糖酵解代谢是恶性肿瘤的显著特征，通过阻断糖酵解途径来抑制癌细胞中能量的生成，从而达到治疗恶性肿瘤。己糖激酶(HK)是糖酵解过程中的第一限速酶，其中HK-Ⅱ已被证实与多种肿瘤的发生发展、侵袭密切相关[1]。蛋白激酶B(PKB)是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(P13K/PKB)信号通路中的关键蛋白。在P13K/PKB通路激活后，通过多种分子机制参与肿瘤的发生发展，目前有研究[2]表明该通路参与了糖酵解酶HK的上游调控。

本研究通过免疫组织化学SP法检测卵巢上皮性癌组织中HK-Ⅱ、PKB蛋白的表达水平，分析二者与卵巢上皮性癌临床病理参数的关系及二者在卵巢上皮性癌组织中表达的相关性，从而明确HK-Ⅱ、PKB在卵巢上皮性癌中的作用及其意义，以期为临床对卵巢上皮性癌的诊断及治疗提供新的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年7月至2017年3月郑州大学附属洛阳中心医院手术切除的标本96例，其中卵巢上皮性癌组织标本(恶性组)56例，年龄(53.4±10.7)岁。均经病理检查诊断为卵巢上皮性癌。按国际妇产科联盟(FIGO)分期：Ⅰ—Ⅱ期20例，Ⅲ—Ⅳ期36例。低分化32例，高、中分化24例。淋巴结转移35例，无淋巴结转移21例。病理类型：浆液性囊腺癌21例，黏液性囊腺癌17例，子宫内膜样腺癌8例。术前均未行放、化疗。卵巢良性上皮性肿瘤组织标本(良性组)20例，年龄(50.4±10.6)岁。其中浆液性囊腺瘤10例，黏液性囊腺瘤10例。正常卵巢上皮组织标本(正常组)20例，年龄(49.8±9.1)岁。均为良性疾病行子宫加附件切除术的组织标本。3组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 检测方法

采用免疫组织化学SP法检测各组HK-Ⅱ和PKB蛋白的表达水平。将手术标本用10%甲醛固定，并进行梯度脱水、透明、浸蜡和包埋，以厚度为4 μm 连续切片。然后，将切片脱蜡、水化、EDTA缓冲液100 ℃修复。修复后，滴加过氧化酶阻断溶液，用动物非免疫血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温封闭。封闭后，滴加一抗HK-Ⅱ(美国Santa Cruz公司，1：100稀释)、PKB(美国R&D公司，1：50稀释)，阴性对照用PBS代替。生物素标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)进行室温孵育。孵育后，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，PBS冲洗。冲洗后，DAB显色。苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检。

1.3 结果判定

HK-Ⅱ蛋白表达于细胞膜和胞质，采取半定量法进行评分[3]。随机选择5个高倍镜(10×40)视野进行观察。按染色强度计分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再按照阳性细胞率计分，阳性细胞百分数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。将上述两种得分相乘，总分<5分为阴性(—)，≥5分为阳性(+)。结果判定在双盲下进行，每张切片分别由2名病理科医师判读。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行数据处理。计数资料比较采用χ2检验；变量间的相关性分析采用Spearman相关性检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HK-Ⅱ、PKB蛋白阳性表达率的比较

恶性组、良性组及正常组HK-Ⅱ蛋白阳性表达率分别为82.1%(46/56)、25.0%(5/20)、10.0%(2/20)。恶性组HK-Ⅱ蛋白阳性表达率显著高于正常组、良性组(P<0.01)，良性组HK-Ⅱ蛋白阳性表达率与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。恶性组、良性组及正常组PKB蛋白阳性表达率分别为69.6%(39/56)、20.0%(4/20)、10.0%(2/20)。恶性组PKB蛋白阳性表达率显著高于正常组、良性组(P<0.01)，良性组PKB蛋白阳性表达率与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。卵巢上皮性癌组织中HK-Ⅱ、PKB的蛋白表达均呈阳性染色，均主要位于细胞膜和细胞质中(封三图1—2)。

2.2 HK-Ⅱ、PKB蛋白表达与卵巢上皮性癌临床病理参数的关系

卵巢上皮性癌组织学分级为高、中分化和病理类型为浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌HK-Ⅱ、PKB蛋白阳性表达率与组织学分级为低分化、病理类型为子宫内膜样腺癌比较差异无统计学意义(P>0.05)。卵巢上皮性癌FIGO分期为Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴结转移HK-Ⅱ、PKB蛋白阳性表达率与FIGO分期为Ⅲ—Ⅳ期、无淋巴结转移比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 HK-Ⅱ、PKB蛋白表达与卵巢上皮性癌临床病理参数的关系

2.3 相关性分析

相关性分析结果显示，卵巢上皮性癌组织中HK-Ⅱ蛋白表达与PKB蛋白表达呈正相关(r=0.402，P<0.05)。

3 讨论

肿瘤细胞的代谢与正常细胞不同，即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞仍主要以糖酵解途径提供能量，这种代谢途径的重塑被称为Warburg效应[4]。近年来，通过阻断糖酵解途径来抑制癌细胞中的能量生成而达到治疗恶性肿瘤的策略正备受关注。HK是细胞糖酵解途径中的第一个限速酶，在调控糖酵解流量中起关键作用，而在肿瘤组织中常发现其同工酶类型、表达量、亚细胞分布及动力学特性等改变，其中HK-Ⅱ与肿瘤特征性代谢、细胞增殖和凋亡密切相关[5]。Hoppe Seyler等[6]研究发现，在宫颈正常组织中HK-Ⅱ不表达或者低表达，而在宫颈癌组织中异常高表达，且与放疗耐受和抵抗有关。进一步研究发现，HK-Ⅱ持续高表达与人乳头瘤病毒癌基因E6/E7的激活有关。刘娜等[7]研究发现，在鼻咽癌组织中HK-Ⅱ表达上调，并与鼻咽癌的发生发展及肿瘤细胞的侵袭能力有关，且高表达HK-Ⅱ的患者预后较差。另有文献[8]报道，抑制HK-Ⅱ的表达可诱导肿瘤细胞及其化疗耐药细胞通过线粒体凋亡途径凋亡，从而提高化疗疗效，并在侵袭性淋巴瘤的研究中得到印证。本研究结果显示，恶性组HK-Ⅱ蛋白阳性表达率显著高于正常组、良性组(P<0.01)，卵巢上皮性癌FIGO分期为Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴结转移HK-Ⅱ蛋白阳性表达率与FIGO分期为Ⅲ—Ⅳ期、无淋巴结转移比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，提示HK-Ⅱ不仅参与了卵巢上皮性癌发生，且与其侵袭、转移密切相关。

P13K/AKT通路是一个经典的抗凋亡、促增殖的信号转导途径，在肿瘤发生发展、侵袭、转移及放化疗抵抗中发挥重要作用。PKB是信号转导途径中重要的蛋白激酶，是P13K/PKB信号转导通路的主要效应分子，其活化与多种肿瘤发生发展有密切的关系。有研究[9]表明，PKB在正常组织中低表达或不表达，而在肺癌、食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤中过表达，并与不良预后有关。本研究结果显示，恶性组PKB蛋白阳性表达率显著高于正常组、良性组(P<0.01)，卵巢上皮性癌FIGO分期为Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴结转移PKB蛋白阳性表达率与FIGO分期为Ⅲ—Ⅳ期、无淋巴结转移比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，其与上述研究结果一致，并提示P13K/AKT通路的激活可能是卵巢上皮性癌发生的始动因素之一，且与卵巢上皮性癌的生物学行为和预后密切相关。

有研究[10]证实，HK-Ⅱ与线粒体结合是调节细胞代谢、增殖和凋亡的关键。HK-Ⅱ与线粒体外膜蛋白(VDAC)结合形成线粒体结合型HK-Ⅱ，并可优先利用线粒体产生ATP，同时解除产物G-6-P对HK-Ⅱ的抑制作用，使糖代谢能够持续、高速地进行，为快速生长的肿瘤细胞提供足够的能量。另外，线粒体结合型HK-Ⅱ能够维持线粒体外膜完整性，并参与线粒体膜通透转换孔复合物的构建，抑制促凋亡因子，阻止线粒体途径诱导的凋亡，进而抑制肿瘤细胞的凋亡。此外，HK-Ⅱ与线粒体的结合涉及多条通路和多种因子，Gottlob等[11]报道，P13K/AKT通路参与了HK的上游调控，PKB的激活能够促使HK-Ⅱ与线粒体VDAC相结合，进而利用ATP参与糖代谢，并通过抑制细胞色素C释放来抑制凋亡。本研究中，相关性分析结果显示，卵巢上皮性癌组织中HK-Ⅱ蛋白表达与PKB蛋白表达呈正相关(r=0.402，P<0.05)，提示HK-Ⅱ、PKB可能协同参与卵巢上皮性癌的发生发展。

综上所述，HK-Ⅱ、PKB蛋白的异常表达可能与卵巢上皮性癌的发生发展密切相关，深入研究糖酵解代谢相关限速酶及其调控机制，有望为卵巢上皮性癌的治疗提供新的靶点。