间充质干细胞在骨折愈合中作用的研究进展

魏 娜，张 萍，于 莉，徐建江

骨折愈合是指骨折、截骨、关节融合和骨移植术后的自然骨连接的过程。其最终结局是损伤的骨组织恢复正常的结构及生物力学功能，涉及到多种细胞的增殖、分化和细胞外基质的合成与钙化等修复过程。骨折愈合有“一期愈合”及“二期愈合”两种形式。一期愈合是指在完全解剖复位和绝对固定的条件下，骨折断端之间发生直接愈合；而二期愈合则是在非绝对固定的情况下的间接愈合。骨折二期愈合以骨痂生长桥愈合为主，是临床常见并一直推崇的骨折愈合方式，主要包括膜内成骨和软骨内成骨两种，膜内成骨的机制为骨化部位的间充质干细胞直接分化为成骨细胞，常见于颅顶骨和面颅诸骨以及锁骨。软骨内成骨是先由间充质干细胞分化形成软骨细胞，软骨细胞终末分化和凋亡，骨基质钙化，再以钙化的骨基质为模板开始延伸完成骨化过程，主要发生在长骨、短骨及部分不规则骨中。骨组织的再生能力较强，骨折后，在骨折处先形成肉芽组织，然后出现软骨细胞、成骨细胞与破骨细胞，形成新生的骨小梁，连接填充于断端之间，称为骨痂。此后几经反复重建修复，可能会恢复骨的原有结构及生理功能。骨折愈合的机制探索越来越吸引广大研究者目光，骨折愈合相关的基础认识也在逐渐形成共识，也一直是骨科领域的研究热点。笔者综述了骨折愈合的相关影响因素和间充质干细胞相关的机制研究进展，力求为进一步研究探索以启发。

1 骨折愈合的影响因素

骨折愈合是一个非常复杂的病理生理过程，涉及多种细胞及细胞因子的共同作用，影响骨折愈合的因素也是多方面的。

1.1 影响骨折愈合的细胞因子 骨折区域内血管的重塑、再生是启动骨折愈合的关键性因素之一，血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前为止唯一发现的能直接作用于血管内皮细胞，有效促进血管再生的细胞生长因子［1］；并且与膜内成骨、软骨内成骨等成骨反应关系密切，在骨折愈合、骨不连及骨缺损的修复中起到正性调节的作用［2］。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）存在于骨基质中，是一种具有很强的成骨诱导作用的酸性蛋白，能够促进骨折的愈合和修复［3-5］。β-转化生长因子（TGF-β），能够促进成骨细胞的增殖以及膜内成骨过程，在细胞和组织中的分布较为广泛。Wildemann等将髓内针涂上TGF-β涂层，用以治疗大鼠胫骨骨折，实验结果显示TGF-β可促进骨折的愈合［6，7］。另外，在骨折愈合的急性反应期，损伤之后，外周血细胞、骨髓内血细胞以及骨髓细胞在损伤部位共同形成血肿，骨折引起的急性反应对于骨折的愈合是十分必要的。

在炎性期，肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1、IL-6、IL-11 及 IL-18 分泌增多，这些细胞因子能够募集炎性细胞并促进血管再生［8］。其中，TNF-α在损伤反应的24 h内浓度达到最高，72 h后又降回到基线。在这个时间段内，巨噬细胞及其他炎症细胞表达TNF-α，并认为能诱发继发性炎症信号以及募集损伤修复所必需的细胞［9］。另外，体外实验显示TNF-α能够促进MSCs的成骨分化［10］。而在所有的白介素中，对骨折影响最重要的是IL-1和IL-6。IL-1在炎症急性期由巨噬细胞激活，在成骨阶段诱导产生IL-6，并促进原始软骨骨痂的形成，并促进骨折区新生血管的形成［11，12］。 另一方面，IL-6 只在急性期生成，能够刺激血管生成，促进产生VEGF，以及成骨细胞和破骨细胞的分化［13］。

此外，近来有报道缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在骨修复中的重要作用，它能影响VEGF对血流的重建，并能调节MSCs的迁移［14］。

1.2 骨折局部力学环境对骨折愈合的影响 骨折区的力学环境是影响骨折愈合一个极其重要的方面。早前德国外科医师Julius Wolff最早提出力学环境对骨骼的改建和维持起重要作用。随后的实验研究和临床实践证明力学环境在骨折愈合中的重要地位。研究表明，高刚度的固定器械可以限制骨断端相对位移 （interfragmentary movement，IFM）从而抑制骨痂形成；一定范围内的IFM能够促进骨痂形成，但过量的IFM会抑制软骨骨痂矿化，甚至造成骨不连的发生［15，16］。除了IFM的大小会影响骨痂形成外，IFM相对于骨折断面的方向也是影响骨痂形成的重要因素。IFM相对于骨折断面的方向主要有轴向挤压、轴向牵拉、侧向剪切和弯曲四种。研究证明，适度的轴向挤压方向IFM能有效地促进骨痂形成并加速软骨内成骨的过程，从而使骨折能够更快更好地愈合。同等大小的轴向牵拉方向的IFM则主要通过膜内成骨的方式促进骨折愈合［17］。侧向剪切和弯曲的IFM抑制骨痂形成，降低骨折愈合组织的强度，延迟骨折愈合时间［18］。应变为在外力作用下，单位长度的材料所发生的形变，即δ=△L/L，一般用百分比表示。不同组织在功能正常的状态下可耐受的应变范围不同，完整骨骼所能承受的应变约为2%（骨折发生前），肉芽组织所能承受的应变则可达到100%。骨折愈合早期，骨折断端以血肿和肉芽组织为主，可承受较大范围的应变。随着软骨骨痂的形成和矿化，骨断端的刚性强度逐渐加大，骨痂的应变逐渐减小，过大或过于频繁的应力会对骨折愈合造成极为不利的影响。

如上所述，二期愈合是最常见的骨折愈合方式，它并不需要完全稳定的微环境，相反，微动和应力反而促进其愈合。但是，如果微动和应力超过一定的幅度，则可能会导致骨折延迟愈合或者骨不连的发生［19］。

虽然骨折愈合期间，力学环境影响骨折修复的重要性已经逐渐受到重视。但力学环境影响骨愈合过程的细胞生物学和分子生物学机制仍不甚清楚。适当的机械牵张力可促使成骨细胞内一些基因的表达增加。如上所述，这些基因在新骨生成过程中都起着重要作用，如早期反应基因 （c-fos、c-jun、cox-2）、BMP、 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）及骨钙素、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、胶原蛋白、TGF-β、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、VEGF、 胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGF）、血小板源性生长因子 （platelet-derived growth factor，PDG）等［20，21］。

1.3 影响骨折愈合的其他因素 生长激素能刺激骨和软骨的生长和分化，增加骨密度。它能直接作用于成骨细胞，促进其增殖、分化，激活ALP，提高基质中的Ca2+浓度。Fukuhara等发现无论是给予甲状旁腺激素合成物的大鼠还是行甲状旁腺切除术的大鼠，骨折愈合进度都有所延迟［22］。切除甲状旁腺的大鼠，软骨内骨化和主要的松质骨的二次重塑都有所延迟，因而导致骨折愈合过程的受损。而给予甲状旁腺激素合成物的大鼠，在早期阶段对骨吸收和形成显示促进作用。在后期阶段，骨形成良好但骨吸收较差，表明二次骨重塑降低了，愈伤组织有所受损。甲状旁腺素可能是骨折愈合的重要因素之一。

2 间充质干细胞在骨折愈合中的作用

2.1 间充质干细胞 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类特殊的干细胞，来源于中胚层的成体干细胞，能够自我增殖并具有多向分化潜能［23］，普遍存在于人体各组织器官中，以骨髓含量最丰富。而骨髓腔中的MSCs作为一种多能干细胞，是成骨细胞的体内来源。间充质干细胞的增殖能力决定着成骨分化能力。大量研究结果显示，MSCs不仅能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等中胚层细胞［24，25］，而且可以向神经细胞、肝细胞、胰岛素细胞等内胚层或外胚层细胞转化［24-27］。

2.2 间充质干细胞的分化与调控 软骨内成骨是体内主要的成骨方式，在MSCs分化为成熟软骨细胞及成骨细胞的过程中，涉及多种转录因子的有序表达，其中 Runx2、Sox9家族是发挥主导作用的调节因子之一。Runx2是MSCs向成骨细胞转化的主控转录因子，能激活与启动MSCs向成骨细胞系分化并能调节成骨细胞的成熟［28，29］；Osterix（OSX）位于成骨细胞分化路径中Runx2的下游，调控成骨细胞的生成［30，31］。Sox9 是 MSCs 向软骨细胞系转化的主控转录因子，对于软骨细胞谱系的生成及软骨特异性蛋白的表达是必不可少的［32］。Runx2、OSX、Sox9的表达水平可以作为MSCs分化方向的直接参考［33］。

2.3 间充质干细胞与骨折愈合 MSCs的迁移对于骨折愈合来说是必要的。骨断端募集的的MSCs的来源至今仍未明确，可能来自于周围组织和/或循环当中，细胞可能的来源包括骨髓、骨膜、血管壁、肌肉、循环血和其他组织器官［34］。有研究显示，当骨骼受损时一系列特殊的分子在受损部位释放出来并进入循环，随后受伤组织部位以及循环中的MSCs迁移至受损部位并向特定组织分化［35］。新近的研究［36］显示，在骨折经久不愈的患者中，采用异体皮质人工骨复合物移植的方法进行治疗，该方法的特色即在于首先提取患者自体髂骨红骨髓分离间充质干细胞并与骨形态发生蛋白共同培养，进一步以异体皮质人工骨为支架材料，同时导入骨形态发生蛋白和间充质干细胞，通过人工合成方式制成人工骨复合物，经手术植入骨缺损患处，在此治疗过程中，骨支架接种骨髓间充质干细胞能促进骨愈合能力，在异位移植中也有成骨的特性，还有研究表明异体骨有良好诱导骨产生的特性，异体骨在软组织中的组织相容性好，无炎症细胞浸润。但该过程具体涉及哪些分子的调节仍然存有争议。

另外，MSCs属于非造血系干细胞，表达CD105、CD73 及 CD44、CD29、CD90， 其中 CD44 是参与骨折愈合的重要因子之一。目前，普遍认为骨髓间充质干细胞表面 CD44表达阳性，CD34表达阴性，实验中即按照 CD44+/CD34-进行骨髓间充质干细胞的鉴定，并移植入股骨骨折动物模型。CD44是一种透明质酸受体［37，38］；早有研究［39］发现，CD44-透明质酸相互作用与细胞迁移能力相关，如T细胞趋向炎症部位和间充质干细胞迁移向损伤部位等。Zhu等［40］通过体外实验发现，与 CD44-/-的骨髓间充质干细胞相比，CD44+/+细胞表现出了更强的迁移能力。新近的文献［41］报道，在骨折中 CD44-透明质酸对骨髓间充质干细胞归巢作用影响明显，发现CD44表达有助于骨髓间充质干细胞的迁移从而对损伤的修复作用，可以推测CD44可能是细胞具有高迁移能力的机制之一。

一直以来，BMP-2被认为对MSCs的募集有着重要的意义，但也有人认为BMP-2只是对骨折的愈合作用很大，而其他的BMPs比如 BMP-7却在祖细胞的募集过程中发挥重大作用。现有报道称，在体内，MSCs的迁移主要是通过SDF-1/CXCL12轴调节。 SDF-1α 显著刺激 VEGF，ANG-1，HGF，TGF-β的表达，并受其受体激动剂AMD3100的抑制［42，43］。 近年来，SDF-1/CXCR4 在骨折愈合及 MSCs迁移过程中的作用逐渐被揭示。在骨骼损伤的急性期，SDF－1在骨膜表达，并使造血干细胞和表达CXCR4的间充质干细胞在损伤部位聚集［28］。另外，Granero－Molto 等［44］研究发现移植的 MSCs 只有当其表达CXCR4时才会聚集到骨折部位，而不表达CXCR4者却没有这个能力。由此推测微动可能促进SDF－1和CXCR4等与MSCs迁移相关的分子在损伤部位的表达和释放，从而导致MSCs大量迁移至骨折区，从而促进骨折的愈合。MSCs进入骨缺损区域后，不但细胞自身可以释放出促进新骨生成的生物活性因子，还可以通过旁分泌机制间接促进新血管的生成与成熟，这一过程对于细胞生长和组织修复至关重要［45，46］。但目前对于力学环境影响骨折区MSCs募集的具体机制及其涉及的相关信号通路，尚需要进一步研究。

综上所述，骨折愈合涉及多方面的因素，而随着研究的不断深入，对于间充质干细胞的认识也越来越来越清晰，骨髓间充质干细胞在骨折愈合中的作用也逐渐被揭示。目前，骨髓间充质干细胞已经开始用于临床骨科疾病的治疗中，例如在股骨头坏死及骨折的延期愈合等疾病的治疗中都取得了可喜的疗效。与此同时，间充质干细胞的体外移植的治疗方法却由于技术操作所局限，存在先天的不足，未能广泛的应用于临床。该综述对骨折愈合的影响因素及骨髓间充质干细胞在骨折愈合作用进行了总结，为骨折愈合的机制的进一步研究提供参考。

［1］ LEUNG DW，CACHIANES G，KUANG WJ，et al.Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen［J］.Science，1989，246（4935）：1306－1309.

［2］ STEINBRECH DS，MEHRARA BJ，SAADEH PB，et al.Hypoxia regulates VEGF expression and cellular proliferation by osteoblasts in vitro［J］.Plastic and Reconstructive Surgery，1999，104（3）：738－747.

［3］ BALTZER AW，LATTERMANN C，WHALEN JD，et al.Genetic enhancement of fracture repair：healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP－2 gene［J］.Gene Therapy－Basingstoke，2000，7（9）：734－739.

［4］ ECKARDT H，CHRISTENSEN KS，LIND M，et al.Recombinant human bone morphogenetic protein 2 enhances bone healing in an experimental model of fractures at risk of non－union［J］.Injury，2005，36（4）：489－494.

［5］ MIYAZAKI M，MORISHITA Y，HE W，et al.A porcine collagenderived matrix as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein－2 enhances spinal fusion in rats［J］.The Spine Journal，2009，9（1）：22－30.

［6］ SCHMIDMAIER G，WILDEMANN B，OSTAPOWICZ D，et al.Long－term effects of local growth factor （IGF－I and TGF－β1）treatment on fracture healing.A safety study for using growth factors［J］.Journal of Orthopaedic Research，2004，22（3）：514－519.

［7］ WILDEMANN B，SCHMIDMAIER G，BRENNER N，et al.Quantification，localization，and expression of IGF－I and TGF－β1 during growth factor－stimulated fracture healing［J］.Calcified Tissue International，2004，74（4）：388－397.

［8］ GERSTENFELD LC，CULLINANE DM，BARNES GL，et al.Fracture healing as a post－natal developmental process：Molecular，spatial，and temporal aspects of its regulation［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2003，88（5）：873－884.

［9］ KON T，CHO TJ，AIZAWA T，et al.Expression of osteoprotegerin，receptor activator of NF－κB ligand（Osteoprotegerin Ligand）and related proinflammatory cytokines during fracture healing［J］.Journal of Bone and Mineral Research，2001，16（6）：1004－1014.

［10］ CHO HH，KYOUNG KM，SEO MJ，et al.Overexpression of CXCR4 increases migration and proliferation of human adipose tissue stromal cells［J］.Stem Cells and Development，2006，15（6）：853－864.

［11］ LEE SK，LORENZO J.Cytokines regulating osteoclast formation and function［J］.Current Opinion in Rheumatology，2006，18（4）：411－418.

［12］ YANG X，RICCIARDI BF，HERNANDEZ－SORIA A，et al.Callus mineralization and maturation are delayed during fracture healing in interleukin－6 knockout mice［J］.Bone，2007，41（6）：928－936.

［13］ CERADINI DJ，KULKARNI AR，CALLAGHAN MJ，et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF－1 induction of SDF－1［J］.Nature Medicine，2004，10（8）：858－864.

［14］ CLAES L，AUGAT P，SUGER G，et al.Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing［J］.Journal of Orthopaedic Research，1997，15（4）：577－584.

［15］ GARDNER MJ，van der MEULEN MCH，DEMETRAKOPOULOS D，et al.In vivo cyclic axial compression affects bone healing in the mouse tibia［J］.Journal of Orthopaedic Research，2006，24（8）：1679－1686.

［16］ HENTE R，FüCHTMEIER B，SCHLEGEL U，et al.The influence of cyclic compression and distraction on the healing of experimental tibial fractures［J］.Journal of Orthopaedic Research，2004，22（4）：709－715.

［17］ AUGAT P，BURGER J，SCHORLEMMER S，et al.Shear movement at the fracture site delays healing in a diaphyseal fracture model［J］.Journal of Orthopaedic Research，2003，21（6）：1011－1017.

［18］ GREEN E，LUBAHN J D，EVANS J.Risk factors，treatment，and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture［J］.Journal of Surgical Orthopaedic Advances，2004，14（2）：64－72.

［19］ BAO－HUI J I，WANG H.The effects of mechanical tension on osteoblasts and bone marrow－derived mesenchymal stem cells［J］.Progress in Modern Biomedicine，2009，25（7）：798.

［20］ WANG CD，XIA YY.The research progress of the fluid shear stress on the osteoblast cell［J］.Journal of Clinical Orthopaedics，2009，34（1）：201－202.

［21］ FUKUHARA H，MIZUNO K.The influence of parathyroid hormone on the process of fracture healing［J］.Nihon Seikeigeka Gakkai Zasshi，1989，63（1）：100－115.

［22］ GANGJI V，H AUZEUR JP.Treatment of osteonecr osis of the femoral head with implantation of autologous bone marrow cells surgical technique［J］.Bone Joint Surg Am，2005，1（1）：106.

［23］ KARAOZ E，AKSOY A，AYHAN S，et al.Characterization of mesenchymal stem cells from rat bone marrow：ultrastructural properties，differentiation potential and immunophenotypic markers［J］.Histochemistry and Cell Biology，2009，132（5）：533－546.

［24］ LI WJ，TULI R，OKAFOR C，et al.A three－dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells［J］.Biomaterials，2005，26（6）：599－609.

［25］ LEE KD，KUO TKC，WHANG－PENG J，et al.In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.Hepatology，2004，40（6）：1275－1284.

［26］ TIMPER K，SEBOEK D，EBERHARDT M，et al.Human adipose tissue－derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin，somatostatin，and glucagon expressing cells［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，341（4）：1135－1140.

［27］ NISHIMURA R，NAKAMURA E，KIDA J，et al.Bone and Stem Cells.Regulation of chondrocyte differentiation from mesenchymal stem cells［J］.Clinical Calcium，2014，24（4）：509－516.

［28］ CHEN H，GHORI－JAVED FY，RASHID H，et al.Runx2 regulates endochondral ossification through control of chondrocyte proliferation and differentiation［J］.Journal of Bone and Mineral Research，2014，29（12）：2653－2665.

［29］ NISHIO Y，DONG Y，PARIS M，et al.Runx2－mediated regulation of the zinc finger Osterix/Sp7 gene［J］.Gene，2006，372（1）：62－70.

［30］ KABACK LA，SOUNG DY，NAIK A，et al.Osterix/Sp7 regulates mesenchymal stem cell mediated endochondral ossification［J］.Journal of Cellular Physiology，2008，214（1）：173－182.

［31］ AKIYAMA H.Control of chondrogenesis by the transcription factor Sox9［J］.Modern Rheumatology，2008，18（3）：213－219.

［32］ CARROLL SH，RAVID K.Differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and chondrocytes：a focus on adenosine receptors［J］.Expert Reviews in Molecular Medicine，2013，15（1）：21.

［33］ ITO H.Chemokines in mesenchymal stem cell therapy for bone repair：a novel concept of recruiting mesenchymal stem cells and the possible cell sources［J］.Modern Rheumatology，2011，21（2）：113－121.

［34］ LIU ZJ，ZHUGE Y，VELAZQUEZ OC.Trafficking and differentiation of mesenchymal stem cells［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2009，106（6）：984－991.

［35］ VEIS A，KOUGIAS K，TSIRLIS A，et al.Evaluation of the osteogenic potential in experimental defects，with and without bone marrow，in the rabbit tibia：a pilot study［J］.Int J Oral Maxillofac Implants，2009，24（6）：1054－1060.

［36］ LESLEY J，HASCALL VC，TAMMI M，et al.Hyaluronan binding by cell surface CD44［J］.J Biol Chem，2000，275（35）：26967－26975.

［37］ PURéE，CUFF CA.A crucial role for CD44 in inflammation［J］.Trends Mol Med，2001，7（5）：213－221.

［38］ DEGRENDELE HC，KOSFISZER M，ESTESS P，et al.CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation［J］.J Immunol，1997，159（6）：2549－2553.

［39］ ZHU H，MITSUHASHI N，KLEIN A，et al.The role of the hyaluronan receptor CD44 in mesenchymal stem cell migration in the extracellular matrix［J］.Stem Cells，2006，24（4）：928－935.

［40］李颖，黎立，李俊玲，等.力学环境对骨折早期骨折端间充质干细胞募集的影响［J］. 国际骨科学杂志，2016，37（5）：198－202.

［41］ ZHU H，MITSUHASHI N，KLEIN EM，et al.Stromal cellderived factor 1/CXCR4 signaling is critical for the recruitment of mesenchymal stem cells to the fracture site during skeletal repair in a mouse model［J］.Arthritis ＆ Rheumatism，2009，60（3）：813－823.

［42］ QIAN D，GONG J，HE Z，et al.Bone marrow－derived mesenchymal stem cells repair necrotic pancreatic tissue and promote angiogenesis by secreting cellular growth factors involved in the SDF－1α/CXCR4 axis in rats［J］.Stem Cells International，2015，25（2）：306836.

［43］ GRANERO－MOLTóF，WEIS JA，MIGA MI，et al.Regenerative effects of transplanted mesenchymal stem cells in fracture healing［J］.Stem Cells，2009，27（8）：1887－1898.

［44］ LADAGE D,BRIXIUS K,STEINGEN C，et al.Mesenchymal stem cells induce endothelial activation via paracine mechanisms［J］.Endothelium，2007，14（2）：53－63.

［45］ SACCHETTI B，FUNARI A，MICHIENZI S，et al.Self－renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment［J］.Cell，2007，131（2）：324－336.