正交试验法优选痛利舒颗粒水提工艺

杨龙飞，丁晓彦，高燕，国锦，孙启慧，赵渤年

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东省中药质量标准研究重点实验室，山东 济南 250014)

痛利舒颗粒是由茵陈、葛根、白芍、栀子等15味中药组成的临床经验方，具有清热利湿、化瘀止痛、益气滋阴之功效，临床上对痛风具有显著的疗效。由于传统汤剂有煎煮不方便、服用量大、质量不可控、不易储存和携带等弊端，为了提高临床疗效、保证药品质量，使该处方更好地服务于临床和广大病患，对汤剂进行了剂型改革。通过对处方的分析，在查阅文献[1-10]和预实验的基础上，根据各药物的理化性质和药理作用，确定了本制剂的提取工艺。该制剂水提取工艺的优化研究，为痛利舒颗粒的工业生产提供了技术支持。

1 仪器、试剂与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；Thermo Syncronis C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BP211D型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

1.2 试剂

乙醇、甲醇、磷酸为分析纯；乙腈为色谱纯；高效液相色谱用水为超纯水。

1.3 试药

生地、山药、枸杞、白术、苍术、白芍、栀子、茵陈、葛根、丹参、黄芪、牛膝、地骨皮、泽泻、甘草(山东建联盛嘉中药有限公司中药饮片厂，质量合格)；栀子苷(批号：0095-201101RS，云南特法特生物科技有限公司)；芍药苷(批号：110736-200731，中国药品生物制品检定所)。

2 方法与结果

2.1 得膏率的测定

按处方量称取饮片，按正交设计分别进行实验，合并滤液，将药液转移至干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃条件下干燥3 h，转移至干燥器中冷却30 min，称重并计算各次实验的得膏率:

2.2 栀子苷含量测定

2.2.1 样品溶液的制备

2.2.1.1 对照品溶液的制备

取栀子苷对照品，精密称定，加甲醇制成50 μg/mL的溶液，即得。

2.2.1.2 供试品溶液的制备

取正交试验工艺提取所得干膏1.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声处理20 min(53 Hz，300 kW)，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得[11]。

2.2.1.3 阴性样品溶液的制备

按处方比例称取除栀子以外的其他药味，按照样品制备方法制备阴性样品，取阴性样品约1.2 g，按2.2.1.2项下方法制备，即得。

2.2.2 色谱条件

2.2.3 专属性考察

吸取不同样品溶液各10 μL进行测定，结果表明，供试品溶液色谱与对照品溶液色谱在相同保留时间处有相应色谱峰，分离度良好，阴性无干扰。色谱图见图1～3。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取不同体积对照品溶液注入液相色谱仪，测定，得回归方程：y=2×106x+9 782.4，r=0.999 5，结果表明，栀子苷在0.10～1.02 μg范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度实验

取栀子苷对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定，相对标准偏差为1.11%，表明仪器精密度良好。

图1 栀子苷对照品溶液HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the reference solution of Gardenoside

图2 供试品溶液HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of Tonglishu Granule

图3 缺栀子阴性样品溶液HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of Gardenia Fructus negative control

2.2.6 重复性实验

取5号干膏粉末1.5 g，平行6份，精密称定，按2.2.1.2项下方法制备供试品溶液，测定，相对标准偏差为2.02%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性实验

取供试品溶液(5号)分别在第0、2、4、8、12、24 h注入液相色谱仪，测定，结果栀子苷峰面积相对标准偏差为1.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 加样回收实验

取5号干膏粉末0.75 g，平行5份，精密称定，分别精密加入浓度为1.89 mg/mL的栀子苷对照品溶液1 mL，按照2.2.1.2项下方法制备供试品溶液，测定，计算得平均回收率为100.58%，相对标准偏差为2.05%。

2.3 芍药苷的含量测定

2.3.1 样品溶液的制备

2.3.1.1 对照品溶液的制备

取芍药苷对照品，精密称定，加甲醇制成30 μg/mL的溶液，即得。

2.3.1.2 供试品溶液的制备

取正交试验工艺提取的干膏1.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，超声处理30 min(53 Hz，300 kW)，放冷，称重，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得[11]。

2.3.1.3 阴性样品溶液的制备

按处方比例称取除白芍以外的其他药味，按照样品制备方法制备阴性样品，取阴性样品约1.4 g，按2.3.1.2项下方法制备，即得。

2.3.2 色谱条件

2.3.3 专属性考察

吸取不同样品溶液各10 μL，测定，结果表明，对照品溶液色谱与供试品溶液色谱在相同保留时间处有相应色谱峰，分离度良好，阴性无干扰。色谱图见图4～6。

图4 芍药苷对照品溶液HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of the reference solution of Paeoniflorin

图5 供试品溶液HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of Tonglishu Granule

图6 缺白芍阴性样品溶液HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of Radix paeoniae alba negative control

2.3.4 线性关系考察

精密吸取不同体积对照品溶液注入色谱仪，测定，得回归方程：y= 1×106x+24 867， r=0.999 9，结果表明，芍药苷在0.06～0.60 μg范围内呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度实验

吸取芍药苷对照品溶液10 μL，连续进样6次， 相对标准偏差为0.30%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性实验

取5号干膏1.5 g，平行6份，精密称定，按2.3.1.2项下方法制备供试品溶液，测定，相对标准偏差为2.79%，该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性实验

取供试品溶液(5号)分别在第0、2、4、8、12、24 h注入液相色谱仪，测定，计算各样品中芍药苷峰面积相对标准偏差为1.34%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.8 加样回收实验

取5号干膏粉末0.75 g，平行5份，精密称定，分别精密加入浓度为33.5 μg/mL芍药苷对照品溶液1 mL，按照2.3.1.2项下方法制备供试品溶液，测定，计算得平均回收率为99.49%，相对标准偏差为1.50%。

2.4 水提工艺的优选

研究资料表明[12-13]，栀子、白芍等药味中的有效成分均具有较好的水溶性，且临床应用时多以水煎剂为主，故在预实验的基础上，以水为提取溶剂，采用L9(34)正交试验法，选取加水量(A)、煎煮时间(B)和煎煮次数(C)制定因素水平表，以得膏率、栀子苷及芍药苷含量作为考察指标，优选水提工艺。正交试验因素水平见表1。

表1 水提工艺正交试验因素水平表Table 1 The orthogonal factor level table of water extraction process

2.5 正交试验结果

评价水煎煮工艺效果的主要指标为栀子苷与芍药苷含量，故将含量测定权重系数定为0.6，芍药苷和栀子苷含量各自为0.3，得膏率在实际生产中也有重要意义，权重系数定为0.4。

综合评分

×0.4。

正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 水煎煮工艺正交试验结果Table 2 Orthogonal test results of water extracting technology

表3 方差分析结果表Table 3 Results of the variance analysis

实验结果表明，水提工艺的煎煮次数(C)对栀子苷与芍药苷的含量和得膏率有显著性影响，以C3为最佳，而对加水量(A)、煎煮时间(B)的影响较小，二者可任选一水平，根据综合评分结果，并考虑到节约能源，降低成本，故选用A2、B2。因此，最佳组合为A2B2C3，即在水提工艺中选用8倍量水，煎煮3次，每次煎煮2 h为水提工艺的适宜条件。

2.6 讨论

痛风在临床上主要表现为高尿酸血症，是由嘌呤类物质代谢紊乱引起的血尿酸浓度持续增高，而使尿酸盐结晶沉积在软组织所导致的一组代谢性疾病[14]。

痛利舒颗粒为多味药组成的复方，在临床上治疗痛风作用显著，且克服了汤剂使用不便、服用量大、不易储存携带等缺陷。为达到提取工艺可控、稳定的目的，本研究采用多指标综合评分来优化提取工艺。根据各药味中成分特点，以水为提取溶剂，成本低、安全性高，且与传统中医用药方法相契合。

指标的选择与综合评分权重比例是根据其药理作用、在制剂中的含量及其在生产中的意义决定的，方中栀子与白芍均可降低血清中尿酸水平[15-16]，故将其作为评价提取工艺的主要指标，并采用HPLC测定栀子苷与芍药苷的含量。通过方差分析，最终确定8倍量水，煎煮3次，每次煎煮2 h为水提工艺适宜条件。优选出的提取工艺具有科学性和合理性，可作为痛利舒颗粒生产中提取工艺的参考，并为下一步质量标准的研究制定提供了实验依据。

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