HPLC-HG-AFS法测定亚砷酸治疗的急性早幼粒细胞白血病患者尿液中砷代谢产物

王文静，胡 爽，郭美华，高春璐，海 鑫（哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001）

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓细胞白血病（AML）的一种特殊类型[1]。亚砷酸在治疗APL上已经取得了良好的疗效，大大提高了APL的缓解率，减少了复发。但与此同时，我们也不能忽视砷在体内蓄积所带来的不良反应，亚砷酸吸收进入人体内后迅速氧化甲基化产生不同的代谢产物，各种不同砷代谢物在体内的分布浓度与其治疗的有效性和毒性有密切联系[2]。

因此，选择适当的生物样本及方法检测砷代谢产物，分析其在形式、分布及变化规律，并根据检测结果做出毒性预警显得尤为必要。目前检测砷代谢产物最常应用的检测仪器为高效液相色谱-电感耦合等离子体-质谱联用仪（HPLC-ICP-MS）[3-6]。ICP-MS具有高灵敏度、选择性好、可多元素同时测定等优点，但是仪器价格和运行费用都很昂贵，并且在测定过程中生成的氯化氩相对分子质量与砷接近，对砷代谢物测定产生干扰，加入试剂减少干扰又将使测定增加难度，限制了它在实际检测工作中的使用。与HPLCICP-MS相比，HPLC-HG-AFS的灵敏度相当，砷灯的使用使其专属性高，干扰少，且仪器价格及运行费用低，仅为ICP-MS的1/10，测量结果准确高效，操作方法简单，便于推广，适合运用于实际临床检测工作中砷含量的测量。

人体摄入的砷，大部分以代谢和未代谢的形式通过尿液排出体外[7]，检测尿液砷中砷形态可评估该患者的砷代谢排泄能力，以及评估毒性蓄积情况。与血液样本相比，尿液样本采集简单方便，且尿液的基质简单，分析前只需稀释过滤，减少了前处理所造成的各种砷代谢产物含量损失。本实验拟建立一个应用HPLC-HG-AFS法测定应用亚砷酸治疗的APL患者尿液中砷代谢产物浓度的方法，旨为临床合理用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器

HPLC-HG-AFS（LC-AFS 6500，北京海光仪器有限公司），超声波清洗仪（CPX 5800 H-C，美国必能信公司），超纯水仪（GENPUREPRO，Thermofisher科技有限公司），真空泵（AP-9950，天津奥特赛恩斯仪器有限公司），多功能高速离心机（5430，德国Eppendorf公司），离心机（AllegraX-22R，美国Beckman Coulter公司），电子天平（TE601-L，德国Sartorius公司）。

1.2 试剂

质量浓度（以砷计）分别为75.7、17.5、25.1、52.9 μg·g-1的亚砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsV）、一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）溶液标准物质（中国计量科学研究院）；无水磷酸二氢钠（99.00%，国药集团化学试剂有限公司）；无水乙酸钠（99.00%，国药集团化学试剂有限公司）；硝酸钾（99.00%，国药集团化学试剂有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（99.00%，国药集团化学试剂有限公司）；硼氢化钾（98.00%，天津化学试剂研究所）；氢氧化钾（82.60%，天津市福晨化学试剂厂）；盐酸（优级纯，天津市永大化学试剂开发中心）；高纯氩气（100.00%，哈尔滨黎明气体有限公司）；超纯水（Thermo fi sher纯水仪自制）。

1.3 临床样本的收集

采集7例临床正在接受亚砷酸治疗的APL患者第7、14、21、28天晨尿，分装，于– 80 ℃保存。

2 方法

2.1 色谱及原子荧光条件

色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X 100柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）；流动相：CH3COONa（13 mmol·L-1）-NaH2PO4（3 mmol·L-1）-KNO3（4 mmol·L-1）-EDTA·2Na（0.2 mmol·L-1），pH =6；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：100 µL。

原子荧光条件：还原液：3% KBH4（m/v）-0.5%KOH（m/v）；载流液：10% HCl溶液（v/v）；主电流：80 mA，辅电流：40 mA；屏蔽气流量：900 mL·min-1；载气流量：300 mL·min-1；负高压：300 V；泵转速：65 r·min-1。

2.2 溶液的配制

储备液配制：用移液器分别精密量取适量AsⅢ标准溶液、AsV标准溶液、DMA标准溶液，MMA标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，用超纯水定量至刻度，分别配成浓度为1000、500、800、500 ng·mL-1的母液，转移到20 mL棕色试样瓶中，置于4 ℃冰箱中避光保存。临用前用流动相稀释得到系列标准工作液。

2.3 尿液样本的处理

将冷冻保存的尿液样本在室温下融化后，用移液器量取尿液60 µL，置于1.5 mL EP管中，加入流动相1140 µL，涡旋30 s混匀后，13 000 r·min-1，4 ℃，离心10 min，过滤取上清液备用。根据预测定的结果再取适量上清液加入适量流动相稀释，混匀后取100 µL进样检测分析。

3 结果

3.1 线性范围及检测限

取AsⅢ、DMA、MMA、AsV标准储备液，分别用流动相稀释成质量浓度在2.0～100.0 ng·mL-1（2.0 ng·mL-1，4.0 ng·mL-1，8.0 ng·mL-1，10.0 ng·mL-1，20.0 ng·mL-1，40.0 ng·mL-1，100.0 ng·mL-1）范围的系列标准工作液。取100 µL进样检测分析，以各形态砷的峰面积（Y）对已知浓度（X）进行回归分析，分别绘图得到标准曲线，直线回归得到相关系数和回归方程。结果表明在2.0～100.0 ng·mL-1范围内呈现良好线性关系。见表1。

表1 砷代谢产物的回归方程及线性范围Tab 1 Regression equation and linear range of arsenic metabolites

3.2 精密度实验

日内精密度的测定：分别配制8.0、40.0、100.0 ng·mL-1的低、中、高浓度质控液各5例，按“2.3”项处理并在同一天测定，计算均值（mean），标准差（SD）及相对标准差RSD（CV/%）[RSD（CV%）=SD/mean×100%]。日间精密度的测定：依照上述方法测定处理，连续测定3 d，同法计算。结果显示，日内RSD ≤ 1.78%，日间RSD ≤ 1.97%。详见表2。

表2 尿样中砷各种代谢物日间精密度和日内精密度分析Tab 2 Intra-day precision and inter-day precision analysis

3.3 准确度实验

取1例患者尿样，分成4组，每组3份。第一组按“2.3”项处理并测定。第二、三、四组取尿样60 μL，加入流动相540 μL，分别向每份尿样中各加入四种砷形态标准溶液，配制成质量浓度分别为8.0、40.0、100.0 ng·mL-1的低、中、高质控液，涡旋混匀30 s，13 000 r·min-1，4 ℃，离心10 min，取上清液过滤，取100 μL进样测定，计算加标回收率。检测结果表明四种砷形态（AsⅢ，DMA，MMA，AsV）的加标回收率均在82.19%～109.18%之间（n=5）。详见表3。

表3 加标回收率分析Tab 3 Analysis of spike recovery

3.4 稳定性实验

室温稳定性：将3例患者样本室温下放置6 h后按“2.3”项处理并测定，进样分析，每组5份。冻融稳定性：将3例患者样本于– 80 ℃冰箱内冷冻24 h后，取出样品，融化完全，再放入冰箱冷冻，反复冻融3次（3 d）后按“2.3”项处理并测定，每组5份。长期稳定性：将3例患者样本于– 80 ℃冰箱内冷冻40 d后，取出样品，按“2.3”项处理并测定，每组5份。以第一天立刻测定的值为参考值，计算存放不同时间的样品下降率（偏差值）。由表可知，四种砷形态偏差值均在– 1.62%～2.01%之间，在±15%范围内，稳定性良好。详见表4。

3.5 临床患者样本测定

另选7例患者尿样，其中2例（1～2）为“慢点法”（0.16 mg·kg-1·d-1，每天持续静注18～20 h）治疗，5例为（3～7）“常规法”（0.16 mg·kg-1·d-1，每天静注2 ～3 h）治疗[8-9]。研究表明，每天连续摄入等剂量的砷（125～1000 μL），5 d内尿液中砷的浓度将达到平衡[10]，因此，分别搜集亚砷酸治疗5 d以后的APL患者晨尿样本，按“2.3”项下所述方法进行处理，进样分析，用已建立标准曲线计算尿样中砷四种代谢产物的浓度。图1为四种形态砷工作液色谱图，“常规法”治疗的APL患者晨尿色谱图，“慢点法”治疗的APL患者晨尿色谱图。采用“慢点法”治疗的患者甲基化程度明显大于“常规法”治疗的患者，且砷排泄量增加，预防体内蓄积。表5为晨尿中砷代谢产物浓度汇总统计分析。

4 讨论

4.1 流动相

目前检测砷形态最常用的流动相为Na2HPO4·12H2O（5 mmol）-KH2PO4（25 mmol·L-1）[11]。在本实验中使用文献中推荐流动相Na2HPO4·12H2O（5 mmol）-KH2PO4（25 mmol·mL-1）时，AsⅢ和DMA的分离度差，并且AsV的峰展宽，峰形不理想。在此基础上，我们对流动相进行多次调整，最后改用CH3COONa（13 mmol·mL-1）-NaH2PO4（3 mmol·mL-1）-KNO3（4 mmol·mL-1）-EDTA·2Na（0.2 mmol·mL-1）作为流动相，四种砷形态（AsⅢ、DMA、MMA、AsV）半峰宽小，峰形对称，能在8 min内分离，且分离度良好。

表4 尿液中砷代谢物稳定性分析Tab 4 Analysis of stability of arsenic metabolites in morning urine

4.2 AFS条件

在实验初期，我们对AFS条件，如还原液和载流液浓度以及主电流、辅电流等进行了探索，经过大量实验比较发现，当HCl和KBH4体积比分别为10%和3%时，基线平稳，4种砷化学态的荧光强度均可达到最大。且在还原液KBH4中加入0.5% KOH可以提高KBH4的稳定性，确保稳定匀速的产生足够的氢。主电流和辅电流在50 mA～25 mA和60 mA～30 mA的条件下，峰形变差，基线不够平稳，荧光强度低，当将主电流和辅电流调至80 mA～40 mA时，可得到理想的峰形，获得更低检测限（2 ng·mL-1）。

图1 HPLC色谱图A–标准溶液（4 ng·mL-1），B –常规法治疗的APL患者晨尿， C–慢点法治疗的APL患者尿样；1–AsⅢ，2–DMA，3–MMA，4–AsVFig 1 HPLC chromatogramsA–standard solution (4 ng·mL-1), B–conventional treated APL patients' morning urine, C–continuously slow rate infused APL patients' morning urine; 1–AsⅢ, 2–DMA, 3–MMA, 4–AsV

表5 晨尿中砷代谢产物浓度统计Tab 5 Concentration statistics of morning urine in arsenic metabolites

4.3 临床样本分析

测量的7例患者样本中，砷代谢产物比例存在明显个体差异，但砷代谢的整体趋势一致，AsV所占的比例最少，一般不超过2.5%，DMA和MMA所占的比例在54.7%～75%之间。我们用MMA/总砷和MMA/DMA来表示甲基化能力，通过实验发现个体甲基化能力差异很大，如患者3尿液中MMA/DMA只有48.1%，而患者4尿液中MMA/DMA高达74%。临床治疗中发现，患者3出现了水肿、肝功能损伤等不良反应，而患者4在治疗中未发现砷相关的不良反应。而甲基化能力的不同是否与患者的年龄、性别、病理状态、治疗阶段（诱导与巩固治疗）、给药方法、临床疗效、不良反应等有关，需进一步研究确定。

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