广灵苦荞黄酮类化合物的分离和鉴定

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(1.山西大同大学应用生物技术研究所，山西 大同 037009；2.山西省农业科学院高寒作物研究所，山西 大同 037008)

苦荞(FagopyrumtatariumGaertn)属于蓼科荞麦属栽培作物，也称为鞑靼荞麦，含有丰富的生物类黄酮物质，具有降低血糖、血脂和抗脂质过氧化的作用，能够有效的降低毛细血管的脆性、有效预防脑出血，同时还具有改善视力的功效[1-4]。临床上主要用于治疗糖尿病、高血糖、高血脂和高血压等。具有很高的药用价值，可以作为功能性食品或药品的原料，在食品和医药工业有着广泛的应用。

苦荞麦在我国分布十分广泛，山西北部地区是苦荞麦的主产区。不同产地苦荞总黄酮含量表现出一定的差异性。本课题组初步对山西广灵苦荞的研究表明，产于山西的苦荞麦中总黄酮含量显著高于湖南、宁夏、贵州、云南等地的苦荞麦。为进一步了解山西特有苦荞品种的黄酮类物质，本试验首次以山西北部地区种植的苦荞品种广灵苦荞2号为研究对象，分离和鉴定了其所含的黄酮类物质。广灵苦荞2号主要种植于山西省大同市广灵县及灵丘县等地，前期化学成分预验发现该品种总黄酮含量较高，因而进一步对广灵苦荞的黄酮类成分进行了分离纯化，本研究报道了从广灵苦荞中分离得到7种黄酮类化合物及其结构鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物材料：广灵苦荞2号种子(由山西省农业科学院高寒作物研究所提供)。

药品和试剂：柱层析用大孔吸附树脂柱(AB-8，天津波鸿树脂科技有限公司)，硅胶(青岛海洋化工股份有限公司)，Sephadex LH-20(上海安玛西亚股份有限公司)，HPLC用色谱纯试剂(上海星可生化有限公司)，其余为分析纯试剂。

仪器：核磁共振仪Bruker ADVANCE 400 MHz(德国布鲁克公司，TMS作为内标)，熔点仪Fisher-Johns(北京市科仪电光仪器厂)，高效液相色谱Agilent 1200型(美国安捷伦公司)。Welch material XB-C 18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮类化合物的提取

荞麦种子去除杂质后，研磨，过60目筛，于105 ℃烘箱中烘至恒重。取苦荞种子粉末2 kg，利用超声波辅助提取苦荞中总黄酮，提取条件为60%的乙醇溶液，料液比为1∶10，抽提温度为70 ℃，提取1 h，反复提取2次，得到苦荞黄酮提取液。将黄酮提取液减压浓缩，阴干后得到粗提取物(73.6 g)。

1.2.2 黄酮类化合物的分离纯化

粗提取物经AB-8型大孔吸附树脂为填料的层析柱，用20%～70%的乙醇溶液以0.5 mL/min的速度梯度洗脱，收集70%乙醇溶液的洗脱液，得到化合物1(2.65 g)，其余洗脱液合并。合并后的洗脱液经硅胶柱层析以氯仿和甲醇梯度洗脱(体积比分别为100∶1，50∶1，20∶1，10∶1)得到4个部分Fr.A-D。Fr.A经硅胶层析柱以石油醚和乙酸乙酯1∶9洗脱后再经凝胶柱Sephadex LH-20以氯仿和甲醇1∶1纯化得到化合物2(20 mg)。Fr.B经反复硅胶层析柱纯化收集到化合物3(16 mg)和化合物4(18 mg)。Fr.C经HPLC分离，以乙腈-水为流动相(1∶5；流速2 mL/min)，得到化合物5(310 mg)和化合物6(23 mg)。Fr.D经HPLC，以甲醇-水为流动相(4∶1；流速2.5 mL/min)，分离得到化合物7(15 mg)。

图1 广灵苦荞中的黄酮化合物

1.2.3 黄酮类化合物的结构鉴定

将沉淀物溶于甲醇，在离子源为ESI源条件下进行MS鉴定；将沉淀物溶于三氯甲烷氘代试剂，在400 MHz条件下进行核磁共振法对所得化合物进行结构鉴定。

2 结果与分析

广灵苦荞中分离到7个黄酮化合物，通过与文献报道的的数据比较，被鉴定为芦丁、表儿茶素、异槲皮素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷，槲皮素、山奈酚、金丝桃苷(结构见图1)。

化合物1：黄色粉末，C27H30O16,ESI-MSm/z：611.2 [M+H]+,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.19(1 H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.38(1 H,d,J=2.0 Hz,H-8),7.53(1 H,d,J=2.1 Hz,H-2′),6.84(1 H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.55(1 H,dd,J=2.1 Hz,8.0 Hz,H-6′),5.35(1 H,d,J=7.2 Hz,H-1′′),4.39(1 H,s,H-11′′′),2.6(1 H,s,5-OH),10.7(1 H,s,7-OH),9.34(1 H,s,4′-OH),1.00(3 H,d,J=6.2 Hz,6′′′-CH3).13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶157.0(C-2),133.8(C-3),177.8(C-4),161.7(C-5),99.2(C-6),164.6(C-7),94.0(C-8),156.9(C-9),104.4(C-10),122.0(C-1′),115.7(C-2′),145.2(C-3′),148.9(C-4′),116.7(C-5′),121.6(C-6′),101.7(C-1′′),74.5(C-2′′),76.9(C-3′′),71.0(C-4′′),76.4(C-5′′),67.4(C-6′′),101.2(C-1′′′),70.8(C-2′′′),70.5(C-3′′′),72.3(C-4′′′),68.7(C-5′′′),18.2(C-6′′′)。以上数据与文献[5]报道一致，经鉴定该化合物为芦丁。

化合物2：黄色粉末，C15H14O6,ESI-MSm/z：291.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.87(1 H,s,H-2′),6.65(1 H,d,J=7.8 Hz,H-6′),6.63(1 H,d,J=7.8 Hz,H-5′),5.88(1 H,d,J=2.4 Hz,H-8),5.70(1 H,d,J=2.4 Hz,H-6),4.72(1 H,s,H-2),3.99(1 H,m,H-3),2.67(1 H,dd,J=16.2 Hz,4.2 Hz,H-4 a),2.47(1 H,dd,J=18.6,4.2 Hz,H-4 b).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶156.5(C-9),156.2(C-7),155.7(C-5),144.8(C-3′),144.5(C-4′),130.5(C-1′),117.9(C-6′),114.9(C-5′),114.7(C-2′),98.4(C-10),95.0(C-6),94.0(C-8),78.2(C-2),64.9(C-3),28.2(C-4)。以上数据与文献[6]报道一致，经鉴定该化合物为表儿茶素。

化合物3：黄色针状结晶，C21H20O12,ESI-MSm/z：465.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.41(1 H,d,J=1.8 Hz,8-H),6.20(1 H,d,J=1.8 Hz,6-H),7.57(1 H,d,J=2.0Hz,2′-H),7.58(1 H,dd,J=2.0,8.5 Hz,6′-H),6.83(1 H,d,J=8.5 Hz,5′-H),5.46(1 H,d,J=7.2 Hz,H-1′′).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶156.7(C-2),133.9(C-3),177.9(C-4),161.7(C-5),99.2(C-6),164.6(C-7),94.0(C-8),156.8(C-9),104.5(C-10),121.7(C-1′),115.7(C-2′),145.3(C-3′),148.9(C-4′),116.7(C-5′),122.1(C-6′),101.5(C-1′′),74.6(C-2′′),77.0(C-3′′),70.5(C-4′′),78.0(C-5′′),61.5(C-6′′)。以上数据与文献[7]、[8]报道一致，经鉴定该化合物为异槲皮素。

化合物4：黄色针状结晶，C21H20O11,ESI-MSm/z：449.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.21(1 H,d,J=1.8 Hz,H-6),6.39(1 H,d,J=1.8 Hz,H-8),7.31(1 H,d,J=2.1Hz,H-2′),6.86(1 H,d,J=8.7 Hz,H-5′),7.26(1 H,dd,J=2.1,8.7 Hz,H-6′),5.26(1 H,d,J=1.3 Hz,H-1′′),12.7(1 H,s,5-OH),10.8(1 H,s,7-OH),9.44(1 H,s,4′-OH),0.82(3 H,d,J=6.0 Hz,6′′-CH 3).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶156.9(C-2),134.7(C-3),178.2(C-4),161.8(C-5),99.2(C-6),164.7(C-7),94.1(C-8),157.8(C-9),104.5(C-10),121.6(C-1′),115.9(C-2′),145.7(C-3′),148.9(C-4′),116.1(C-5′),121.2(C-6′),102.3(C-1′′),70.8(C-2′′),71.0(C-3′′),71.6(C-4′′),70.5(C-5′′),18.0(C-6′′)。以上数据与文献报道一致[7]，经鉴定该化合物为槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

化合物5：黄色粉末，C15H10O7,ESI-MSm/z：303.0[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.19(1 H,d,J=1.8 Hz,6-H),6.41(1 H,d,J=1.8 Hz,8-H),6.88(1 H,d,J=8.4 Hz,5′-H),7.54(1 H,dd,J=2.0,8.4 Hz,6′-H),7.68(1 H,d,J=2.0 Hz,2′-H),9.34(1 H,s,3′-OH),9.40(1 H,s,4′-OH),9.62(1 H,s,3-OH),10.80(1 H,s,7-OH),12.51(1 H,s,5-OH).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶147.2(C-2),136.2(C-3),176.3(C-4),161.2(C-5),98.6(C-6),164.3(C-7),93.8(C-8),156.6(C-9),103.5(C-10),122.4(C-1′),115.5(C-2′),145.5(C-3′),148.2(C-4′),116.1(C-5′),120.4(C-6′)。以上数据与文献[9]报道一致，经鉴定该化合物为槲皮素。

化合物6：黄色针状结晶，C5H10O6,ESI-MSm/z：287.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.17(1 H,d,J=2.0 Hz,6-H),6.44(1 H,d,J=2.0 Hz,8-H),6.93(2 H,d,J=8.7 Hz,3′,5′-H),8.05(2 H,d,J=8.7 Hz,2′,6′-H),12.49(1 H,s,5-OH),10.81(1 H,s,7-OH),9.44(1 H,s,3′-OH),10.13(1 H,s,4′-OH),13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶146.9(2-C),135.8(3-C),176.0(4-C),156.3(5-C),98.3(6-C),164.0(7-C),93.6(8-C),160.8(9-C),103.1(10-C),121.8(1′-C),129.6(2′-C),115.5(3′-C),159.3(4′-C),115.5(5′-C),129.6(6′-C),以上数据与文献[10]报道一致，经鉴定该化合物为山奈酚。

化合物7：黄色针状结晶，C21H20O11,ESI-MSm/z：465.1[M+H]+,1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶12.64(1 H,s,5-OH),10.96(1 H,s,7-OH),9.81(1 H,s,3′-OH),9.26(1 H,s,4′-OH),7.66(1 H,dd,J=4.0 Hz,8.0 Hz,6′-H),7.54(1 H,d,J=4.0 Hz,2′-H),6.82(1 H,d,J=8.0 Hz,5′-H),6.41(1 H,d,J=4.0 Hz,8-H),6.20(1 H,d,J=4.0 Hz,6-H),5.38(1 H,d,J=8.0 Hz,1′′-H).13CNMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶177.93(C-4),164.58(C-7),161.66(C-5),156.74(C-2),148.92(C-4′),145.27(C-3′),133.91(C-3),122.42(C-6′),121.52(C-1′),116.39(C-5′),115.63(C-2′),104.36(C-10),102.23(C-1′′),99.12(C-6),93.97(C-8),76.27(C-5′′),73.34(C-3′′),71.64(C-2′′),68.36(C-4′′),60.57(C-6′′)。以上数据与文献[11]报道一致，经鉴定该化合物为槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(金丝桃苷)。

3 结 论

本研究首次对苦荞麦品种“广灵苦荞2号”籽粒的黄酮化合物进行了分离和结构鉴定，其中化合物2-5和7为首次从广灵苦荞中分离。由已鉴定出的化合物来看，该品种苦荞麦籽粒含有丰富的黄酮类物质，可以作为黄酮类化合物的新来源。其结果为苦荞麦的深加工提供了有益参考，也为当地大规模综合开发利用该资源提供了理论依据。但本研究仅对广灵苦荞的黄酮类化合物的类别进行了初步探讨，需要进一步对其提取工艺进行改进，随着新的提取分离技术的应用，可能会有更多的黄酮类成分会从广灵苦荞发现，而对于已分离的黄酮类成分的提取量也会进一步提高。同时在分离工艺的优化中，应充分考虑质量与数量的统一，对具有营养价值和应用价值的成分设计出更加简便有效的工艺，进一步提高提取率和产品收益率。

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