外源褪黑素对深层发酵灵芝酸产量的影响

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(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

褪黑素(melatonin，MT)最早在1958年从牛松果体中分离得到的一种短半衰期的小分子神经递质，化学名N-乙酰基-5甲氧基色胺，是一种高度双亲性(亲脂性和亲水性)吲哚胺类化合物，由于其代谢产物2-羟基褪黑素、N-乙酰基血清素、5-甲氧基色胺等均具有较强抗氧化性，故认为MT具有级联抗氧化效应。在动物和人体中具有提高睡眠质量、提高机体免疫力、抗氧化、抗凋亡、延缓衰老、抑制肿瘤细胞生长等多种药理功能[1-3]。随着检测技术的发展，1995年首次在植物的果实、茎和叶等器官均发现MT的存在，以植物种子中含量最高，在植物体中发挥着调节昼夜节律和光周期、调节植物生长发育、抗生物和非生物逆境(重金属、盐害、病原菌等)等生理作用[4]。研究表明，光合细菌细胞中MT能够保护光合作用色素，酿酒酵母发酵过程中产生的MT可以上调SOD、CAT、GPX的活性和硫氧还蛋白基因表达水平，增强酵母在过氧化氢、UV等胁迫时的抵御能力[5-7]。

研究表明，在培养基中添加一定浓度的水杨酸、乙烯、茉莉酸和一氧化氮等物质均可激活灵芝酸生物合成途径中关键酶基因的表达，诱导灵芝酸的生物合成[8-10]。既然植物MT与水杨酸、生长素和一氧化氮等植物激素存在着一定的互作与对话，那么MT可能具有诱导灵芝菌丝体产生灵芝酸的作用[11]。本文在灵芝菌丝体发酵的对数生长期添加MT作为诱导剂，研究了MT对抗癌剂灵芝酸诱导作用的浓度效应和时间效应，初步探索MT在真菌灵芝中的生物功能，以期提高灵芝酸产量，为大规模发酵生产灵芝酸提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

灵芝菌种(Ganodermalucidum)由上海农科院食用菌研究所提供。

1.2 仪器与设备

756-MC型可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；YXQ-LS50S11立式压力蒸汽灭菌器(上海云泰仪器仪表有限公司)；HZ-300 L恒温摇床(武汉瑞华仪器设备有限公司)；TGL-16G高速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司)；SW-CJ-2FD双人单面净化工作台(郑州南北仪器设备有限公司)；XHF-D高速分散器等(宁波新芝生物科技股份有限公司)。乙醇(分析纯，合肥工业大学化学试剂厂)；熊果酸、高氯酸、香草醛、冰乙酸、蛋白胨均为分析纯(国药试剂公司)。

1.3 菌种培养与处理

灵芝菌种在斜面培养基(马铃薯200 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂 15 g/L)中保存；接种至种子液培养基(马铃薯200 g、KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L)培养种子液；接种在液体培养基(KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、葡萄糖20 g/L、玉米粉4 g/L、蛋白胨10 g/L)进行发酵，接种量5%；250 mL三角锥形瓶中装液量100 mL；28 ℃，150 rpm，培养时间依试验需要确定。

1.4 生物量测定

发酵液在6 000 rpm 离心10 min，弃上清，将沉淀于-50 ℃真空冷冻干燥至恒重，称重。

1.5 标准曲线

准确称取熊果酸标准品5.0 mg，溶于乙酸乙酯定容至50.0 mL容量瓶中，混匀得熊果酸标准溶液(100 mg/L)。分别取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL熊果酸标准溶液置于带盖试管，加热挥去溶剂，加入现配制的0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸和1.0 mL高氯酸，在65 ℃加热15 min，冷却至室温，加入5.0 mL冰乙酸，摇匀静置15 min，于547.5 nm测定吸光值，标准曲线为：y=0.008 8X+0.079 7(R2=0.998 2)。

1.6 灵芝酸提取与测定

称取干燥菌丝体0.1 g，加入10 mL乙醇，常温超声波3 h，6 000 rpm离心20 min，取上清液5 mL，重复浸提3次，合并上清液。根据标准曲线法测定灵芝酸含量，并计算其产量。

1.7 数据处理与统计分析

数据处理使用Excel 2007；统计分析使用SPSS 19.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同浓度褪黑素对深层发酵灵芝菌丝体生物量、灵芝酸含量和产量的影响

图1 不同浓度褪黑素对灵芝菌丝生物量(A)、灵芝酸含量(B)和灵芝酸产量(C)的影响

种子液扩大培养至第3天时添加除菌的不同浓度褪黑素溶液，继续培养至第7天收获菌丝体。由图1A可知，褪黑素浓度为10、20、30、50、100 μmol/L试验组菌丝体生物量均高于对照组，其中50 μmol/L试验组菌丝体生物量为7.91 g/L。由于褪黑素浓度为20 μmol/L时，灵芝酸含量与灵芝酸产量均达到最大值，分别为32.29、244.53 mg/L(图1B、1C)，故优选该浓度进行后续试验。

2.2 不同时间褪黑素对深层发酵灵芝菌丝体生物量、灵芝酸含量和产量的影响

在扩大培养不同时间添加20 μmol/L褪黑素，继续培养至第7天收获菌丝体，探究褪黑素不同添加时间对灵芝深层发酵的影响。结果表明，第4 d加入褪黑素显著提高灵芝菌丝体生物量(图2A)，且提高灵芝酸含量与产量最明显(P<0.05)，分别达到31.66、358.69 mg/L，为对照组的1.39、1.74倍。故下面试验选择第4天加入褪黑素。

图2 褪黑素不同添加时间对灵芝菌丝生物量(A)、灵芝酸含量(B)和灵芝酸产量(C)的影响

2.3 不同收获时间褪黑素对深层发酵灵芝菌丝体生物量、灵芝酸含量和产量的影响

在菌丝体扩大培养至第4天时加入20 μmol/L褪黑素，继续培养至第5、7、8、9、11天收获菌丝体。结果表明，第11天收获菌丝体生物量最高(图3A)，第8天收获时灵芝酸含量(图3B)与产量(图3C)均达到最大值。

综上所述，本试验获得最佳方案为：扩大培养至培养第4天加入20 μmol/L褪黑素，继续培养第8天收获菌丝体，灵芝酸产量达到最大值393.88 mg/L。

图3 不同收获时间对灵芝菌丝生物量(A)、灵芝酸含量(B)和灵芝酸产量(C)的影响

3 结论与讨论

目前，有关褪黑素在在动物和植物细胞内抵御不良环境引起的氧化胁迫方面的研究报道较多，其主要作用方式如下：(1)作为强抗氧化剂，褪黑素可以直接清除羟基自由基等活性氧，(2)刺激SOD、CAT和GPX等抗氧化酶活性升高而增强细胞抗氧化能力;(3)提升细胞内还原型谷胱甘肽和抗坏血酸等含量;(4)提高线粒体内膜上电子传递体的效率而减少活性氧的生成[12-13]。有关褪黑素在微生物中的相关研究非常少，仅有几篇文献报道酿酒酵母在发酵过程中细胞内褪黑素水平与其生长曲线呈现正相关，可能具有促进生长代谢作用[14-15]，外源褪黑素处理可以上调酿酒酵母细胞中SOD、CAT、GPX酶活性和硫氧还蛋白基因表达水平，增强酵母在过氧化氢、UV等胁迫时的抵御能力[5-7]，其具体的生理功能未见报道。不过，经酵母发酵的食品(如面包、啤酒、红酒和果酒等)中褪黑素及其同分异构体含量显著升高，表明褪黑素及其同分异构体与微生物有着密不可分的关系[16]。

在动物和植物细胞中，褪黑素作为诱导剂诱导次生代谢产物方面的研究报道较少。最近，许丽丽等的研究表明，100 μmol/L褪黑素浸泡转色期的葡萄果实，能够诱导上调30个葡萄芪类合酶基因sts表达，显著提高葡萄果实中白藜芦醇含量[17]。Gong等的研究发现，5 μmol/L褪黑素浇灌处理Malus hupehensis，可以上调多胺生物合成相关的6个关键酶基因转录水平，提高细胞中多胺含量，从而增强抗碱胁迫能力[18]。李大菲等报道，1 μmol/L褪黑素和光照联合胁迫单针藻细胞，乙酰辅酶A羧化酶和苹果酸酶活性上升而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性下调，有效促进了微藻细胞油脂的积累[19]。

本研究表明，10～100 μmol/L褪黑素溶液处理均能提高灵芝菌丝体生物量(图1A)，说明褪黑素具有促进灵芝菌丝生长的作用，这与Bisquert等以酵母为材料的研究结果相一致。一般认为褪黑素可以缩短真菌生长滞后期，使其提前进入对数生长期[6]。液体发酵培养至第4天加入褪黑素，继续培养至第8天收获能够显著提高灵芝酸含量和灵芝酸产量，这符合灵芝生长规律和次生代谢产物产生规律[7]。这是有关褪黑素在大型真菌灵芝菌丝上应用的首次报道，其具体的诱导机制可能与水杨酸和生长素等类似。近来的研究发现，水杨酸、乙烯、茉莉酸和生长素等植物激素均可诱导灵芝酸生物合成相关酶的基因表达，从而提高灵芝酸含量[9-10]；由于褪黑素的化学结构与生长素类似，其在植物中的生理功能与生长素和水杨酸等有相同之处，褪黑素可能是通过与水杨酸或者生长素等信号转导途径诱导灵芝酸的生物合成[4]。

此外，灵芝酸的合作需要氧化胁迫环境，一定浓度的水杨酸、一氧化氮、过氧化氢和醋酸等物质可诱导活性氧水平的提高，诱导灵芝酸MVA生物合成途径中相关酶基因的表达，从而促进灵芝酸生物合成[9]。在动物细胞内的褪黑素发挥抗癌作用时，是通过刺激脂氧合酶活性而促发活性氧产生[1]。Gong等研究显示，褪黑素通过降低番茄细胞中的一氧化氮解除NADPH氧化酶的硝酰化状态而使酶活性升高，从而促使信号分子H2O2水平升高，刺激抗性基因表达水平上调，最终促发碱氧化胁迫耐性[20]。灵芝细胞中的褪黑素是通过刺激脂氧合酶活性还是解除NADPH氧化酶硝酰化而促进H2O2等活性氧产生，从而导致灵芝酸生物合成能力增强，有待进一步研究。