豫芝11号种子发育过程中蛋白质及其组分的变化规律

韩亚飞，汪学德，郑永战，梅鸿献，魏安池，刘艳阳

（1河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001；2河南省农业科学院芝麻研究中心，郑州 450008）

0 引言

【研究意义】芝麻种子中一般含有18%—22%蛋白质，是芝麻种子重要组成部分。目前芝麻饼粕研究应用较多，但芝麻蛋白作为营养强化剂在食品领域的应用有待进一步加强[1-2]；芝麻蛋白质中必需氨基酸含量丰富，除赖氨酸含量较低，其他必需氨基酸均达到 FAO/WHO规定[3]。对芝麻蛋白质及组分的变化规律进行研究，比较不同试验点蛋白质含量和组分的差异性，分析蛋白质相对分子质量变化规律以及氨基酸组成变化，对芝麻品质育种及其蛋白质的开发利用具有重要意义。【前人研究进展】张秀荣等[4]通过对中芝11研究发现种子中粗蛋白在种子发育15 d以前就达到一定水平，随后缓慢增加。甄志高等[5]研究了气象条件对夏芝麻蛋白质和脂肪酸含量的影响，通过对2000—2002年全国芝麻区试品系的粗蛋白和粗脂肪含量测定分析，发现温度是影响蛋白质的主导因子。芝麻种子中蛋白质按照其溶解度可以分为白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[6-7]。蛋白质组分的动态变化规律研究已有报道[8-10]，成熟芝麻种子中白蛋白占8.6%、球蛋白占67.3%、醇溶蛋白占1.3%、谷蛋白占6.9%[11]，但是种子发育过程中的蛋白质组分变化尚未见报道。世界粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）在1973年提出了蛋白质营养价值评价方法——必需氨基酸比值系数法[12]。HA 等[13]研究了芝麻种子萌发过程中氨基酸变化，发现随着萌发过程的延长，氨基酸含量显著上升。但是关于芝麻种子发育过程中的氨基酸变化规律并未见报道。【本研究切入点】虽然对生长过程中芝麻蛋白质含量已有研究，但一般局限在生长过程中蛋白质累积变化，对生长过程中四种芝麻蛋白质组成变化并未涉及，而芝麻生长过程中蛋白质分子量和氨基酸组成变化对芝麻蛋白利用具有重要作用。【拟解决的关键问题】明确种子发育时间和环境对芝麻种子蛋白质组分、蛋白质相对分子质量和氨基酸组成及积累特征的影响，以期为芝麻高蛋白遗传改良和芝麻蛋白质的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 分析仪器及试剂

电泳仪ESP-300：上海天能电仪厂；FOSS全自动凯氏定氮仪Kjeltec8400：福斯分析仪器公司；离心机LD5-10：北京京力离心机有限公司；LGJ-18真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；塞卡姆氨基酸分析仪：德国塞卡姆公司；低分子量标准蛋白质：北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其他试验试剂均采用分析纯。

1.2 材料准备

试验材料豫芝 11号由河南农业科学院芝麻研究中心提供，于 2016年6月 11号在周口（33.64°N，114.72°E）、南阳（33.01°N，112.53°E）和驻马店（32.95°N，113.97°E）3个试验点同期播种。于盛花初期在试验田中随机选取当日盛开的花朵进行标记，一次性标记5 000朵并记录标记日期。芝麻开花授粉后第10天开始取蒴，此后每5 d取样一次至芝麻成熟。带蒴样品保存在-40℃条件下，待取样批次结束后统一去壳、冷冻干燥后储藏备用。

1.3 蛋白质含量测定

样品的粗蛋白含量按照 GB50095-2010食品中蛋白质的测定方法进行测定；不同组分蛋白质含量的测定参照Osboren蛋白分类方法进行测定[14]。

1.3.1 清蛋白组分 称取1.0000 g脱脂芝麻，料液比1∶15，在常温下搅拌萃取20 min，经4 000 r/min离心10 min后将上清液转移至50 mL容量瓶中，重复2次，定容，用快速滤纸过滤，弃去最初滤液，移取10 mL滤液进行蛋白质含量分析。

1.3.2 球蛋白组分 按料液比 1∶10向除去清蛋白组分的沉淀中加入5% NaCl溶液，在常温下搅拌30min，经离心后转移至50 mL容量瓶，重复上述操作2次，定容。经过滤后测定球蛋白含量。

1.3.3 醇溶蛋白组分 按料液比 1∶15向除去清蛋白组分和球蛋白组分的沉淀中加入 70%乙醇，在 60℃水浴中搅拌60 min，离心，50 mL容量瓶定容，过滤后测定醇溶蛋白质含量。

1.3.4 谷蛋白组分 按照料液比 1∶10向除去清蛋白组分、球蛋白组分和醇溶蛋白组分的沉淀中加入0.2%NaOH溶液，在常温下搅拌40 min，离心，50 mL容量瓶定容，测定谷蛋白含量。

1.4 SDS-PAGE凝胶电泳

参照郭尧君[15]SDS-PAGE不连续凝胶制备方法进行制备，根据分离要求，配制分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%。浓缩胶过程电压100 V，分离胶过程电压120 V。

1.5 芝麻氨基酸组成分析

评价蛋白质品质一般包括氨基酸种类，数量和含量。按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》和NY/T57-1987《谷物籽粒色氨酸测定法》方法测定脱脂芝麻蛋白粕中的氨基酸组成。氨基酸平衡理论以FAO/WHO的必需氨基酸标准模式，按照公式计算必需氨基酸比值，氨基酸的主要参数有：

氨基酸比值（RAA）=芝麻蛋白某种氨基酸/标准模式中氨基酸含量；

氨基酸比值系数（RC）=氨基酸比值/氨基酸比值平均数。

如果食物中氨基酸含量与标准模式相同，则氨基酸比值系数为1，大于1表示该氨基酸含量过量，小于 1表示该氨基酸含量不足；RC最小表示该氨基酸为此食物中的第一限制性氨基酸。

氨基酸比值系数分：SRC=100-CV×100

式中，CV为变异系数，CV=标准差/均数，SRC越大，表示蛋白质样品越接近标准模式，其营养价值越高。

2 结果

2.1 芝麻种子粗蛋白质含量及其组分的变化

发育过程中的芝麻种子粗蛋白的含量如图 1所示，芝麻授粉后10—20 d，种子中蛋白质含量增加较快，从 9.83%增加到 17.47%，增加率为 77.72%，20—35 d缓慢增加，从17.47%增加到20.86%，增加率为19.43%；35—40 d变化不大，3个试验点趋势相似。周口试验点芝麻粗蛋白含量从15 d开始显著低于南阳和驻马店试验点，这种趋势直至芝麻成熟。从测定节点看，周口试验点10—30 d内蛋白质含量差异性显著，30—40 d无显著差异；南阳和驻马店试验点除20 d和35—40 d南阳试验点蛋白质含量显著低于驻马店试验点，其他取样节点不存在显著性差异。周口试验点在授粉后30 d左右达到最大，此后保持稳定；而南阳和驻马店试验点35 d积累量最高，此后保持稳定。

图1 3个试验点豫芝11种子发育过程中的蛋白质含量积累特征Fig. 1 Accumulation characteristics of Yuzhi11 sesame protein content of growth period in three test areas

从表1和图2中清蛋白组分可以看出，豫芝11号种子发育过程中清蛋白含量并非一直上升，与芝麻粗蛋白含量变化规律不同。其中，20 d含量达到最大，此后下降，30 d与10 d的蛋白质含量接近，30—40 d虽略有上升，但较平缓。周口试验点芝麻种子中清蛋白含量在授粉后10 d与南阳和驻马店两个试验点无显著差异性，授粉后15—25 d，周口试验点清蛋白积累量显著低于其他试验点，此时种子中清蛋白积累量降低，清蛋白含量在授粉后30 d时达到最低，随后清蛋白含量缓慢升高；3个试验点清蛋白累积含量无显著性差异，说明环境对清蛋白含量累积无显著影响，但环境因素能够造成芝麻生长过程中清蛋白含量变化。球蛋白含量随种子发育进程逐渐上升，其变化规律与粗蛋白含量变化一致。在4种蛋白组分中球蛋白含量增加最多，从1.37%增加到31.73%，授粉后30 d，球蛋白含量达到最大，占芝麻脱脂蛋白的50%以上，醇溶蛋白和谷蛋白含量在芝麻整个生长过程中呈现出波动状态。

表1 3个试验点豫芝11种子发育过程中4种蛋白质组分积累特征Table 1 Accumulation characteristics of Yuzhi11 sesame protein component of growth period in three test areas

2.2 SDS-PAGE凝胶电泳分析

图3中A，B和C分别表示周口、南阳和驻马店3个试验点豫芝11号种子不同发育时间的蛋白质凝胶电泳图谱。从图中可以看出，芝麻授粉后10 d，第一泳道上在20 kD和31 kD处出现模糊条带，此时蛋白质含量约9.78%；授粉后15 d，芝麻蛋白质在20 kD和31 kD处积聚较快，同时37 kD、55 kD处蛋白质大分子开始合成；随着发育时间的延长，种子中大分子蛋白质含量逐渐增加，与授粉后15 d后相比，授粉20 d后种子中20 kD、31 kD蛋白大分子增加量明显，在55 kD处蛋白大分子种类增多，授粉25—30 d，37 kD处蛋白分子逐渐消失，同时55 kD处蛋白质大分子持续增加。据此可推测，随着种子的发育小分子蛋白质逐渐合成大分子蛋白质，授粉35 d，芝麻种子中存在的蛋白质分子量主要分布在20 kD、31 kD和55 kD处，且20 kD和31 kD处蛋白质含量丰富。

2.3 氨基酸组成的变化

图2 不同地点种子发育过程中蛋白含量Fig. 2 Protein content of different areas and growth period

图3 不同地点及生长发育期凝胶电泳图Fig. 3 Gel electrophoresis figures of different areas and growth period

表2 不同试验点的豫芝11 号种子发育过程中氨基酸组成Table 2 Compose of amino acid of Yuzhi11 sesame of growth period in three test areas (%)

从表2可以看出，豫芝11号种子中检测出17种氨基酸，其中含有8种必需氨基酸（苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）。氨基酸含量在发育过程中呈现出逐渐增加趋势，谷氨酸和精氨酸是含量最多的两种氨基酸，分别占总氨基酸25.52%和19.32%。赖氨酸含量呈现出先升高后降低的趋势，在20 d时赖氨酸含量达到最大，此时芝麻清蛋白含量最大。蛋氨酸等含硫氨基酸的存在，降低了芝麻蛋白的水溶性。周口、南阳和驻马店3个试验点芝麻种子蛋白质中的必需氨基酸占总氨基酸含量随着种子发育时间的延长呈下降趋势，周口试验点必需氨基酸占总氨基酸含量从42.29%下降至35.28%，南阳和驻马店试验点从40.03%下降至32.60%。

表3 不同试验点的豫芝11号种子发育过程中氨基酸系数及氨基酸比值系数分Table 3 Ratio coefficient and score of ratio coefficient of Yuzhi11 sesame protein of growth period in three test areas

从表 3可以看出，人体必需的氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸的比值系数大于 1，含量丰富。第一限制性氨基酸随生长时间延长而变化，在授粉10 d和15—20 d，第一限制氨基酸分别为甲硫氨酸和色氨酸，25—30 d蛋白质的第一限制性氨基酸为苏氨酸，芝麻授粉35 d，蛋白质第一限制氨基酸为赖氨酸。在种子发育过程中，赖氨酸的比值系数从1.10减少至0.51，与其他氨基酸比值系数变化趋势表现出显著差异性；从氨基酸比值系数分可以看出，芝麻蛋白评分较低，与标准模式下氨基酸组成差别较大。3个试验点芝麻蛋白质氨基酸比值系数分均呈现先升高后降低的趋势，在授粉后25 d氨基酸比值系数分达到最大。周口试验点氨基酸评分显著低于南阳和驻马店两个试验点，主要是由于周口试验点苏氨酸评分显著低于南阳和驻马店地区。

3 讨论

芝麻种子发育过程中蛋白质含量变化呈现出先升后平稳的趋势，这与其他油料作物（如大豆和蓖麻籽）蛋白质积累规律一致[16-17]。芝麻授粉15—40 d，周口试验点芝麻蛋白质含量显著低于南阳和驻马店试验点，这与前人研究发现芝麻蛋白含量随纬度升高而降低的结果一致[18-19]；芝麻种子中蛋白质含量在授粉后35 d达到最大，这与CHUNG[20]、胡华丽等[21]研究结果一致。芝麻种子中清蛋白含量在生长发育时期呈现出先升后降的趋势，清蛋白含量变化与种子内蛋白质合成相关酶活力有关[22]；环境对芝麻种子中清蛋白组分含量影响不大，这与张学林等[23]研究结果不同，这可能是由于本研究试验点设置纬度差异较小。清蛋白和球蛋白是芝麻蛋白重要组分，成熟种子中占粗蛋白总量的 13.75%和 70.94%，对芝麻清蛋白和球蛋白进行分离纯化，并对其性质进行研究对芝麻蛋白质加工利用具有重要作用。醇溶蛋白中含有赖氨酸，精氨酸和组氨酸等必需氨基酸[24]，在芝麻种子的整个生长发育过程醇溶蛋白含量较低且变化不显著，这与芝麻种子蛋白质中赖氨酸含量较低有一定关系；醇溶蛋白和谷蛋白含量较低，芝麻蛋白质的性质与小麦和玉米的蛋白质有较大区别。

豫芝11号种子发育过程中蛋白质主要集中在20 kD和31 kD处，在授粉后10 d出现模糊条带后条带逐渐加深至种子成熟，授粉后15 d，在37 kD和50 kD处出现条带，且随着种子发育时间的延长，37 kD处条带逐渐消失而50 kD处条带数增加，表明不同蛋白质在种子中合成时期不同，随着种子发育时间的延长，小分子蛋白质逐渐转化为大分子。芝麻蛋白质相对分子质量主要集中在 20—30 kD，此类蛋白质广泛存在于豆类植物中，对种子储藏蛋白形成具有重要意义[25]。

芝麻种子中含有17种氨基酸，其中谷氨酸和精氨酸含量最高。谷氨酸能与氯化钠反应产生鲜味[26]，精氨酸对芝麻油风味的形成具有重要作用[27-29]。随着种子发育时间的延长，必需氨基酸占总氨基酸含量逐渐下降，周口试验点必需氨基酸占总氨基酸比例显著高于南阳和驻马店试验点，这与常旭虹等[30]研究小麦种子中必需氨基酸占总氨基酸比例随纬度升高而增大的结果一致；通过芝麻氨基酸评分和比值系数分的比较发现，芝麻种子发育过程中限制性氨基酸依次为蛋氨酸，苏氨酸和赖氨酸；一方面，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸比值系数大于 1，芝麻蛋白能够很好的补充缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸；另一方面，在芝麻授粉后25 d，氨基酸比值系数分达到最大，周口试验点评分显著低于南阳和驻马店试验点，表明生长环境对必需氨基酸的合成有一定影响，这与SHEWRY等[31]研究结果一致。赖氨酸含量呈现先增后减的趋势，其变化规律与清蛋白含量具有一致性，但其联系未探明。

4 结论

生长环境对芝麻蛋白质含量影响显著，通过改变芝麻生长环境可显著提高芝麻籽粒中蛋白质含量。球蛋白含量变化趋势与粗蛋白含量具有一致性，清蛋白在生长过程中受环境影响显著，其变化趋势与籽粒中赖氨酸含量具有一致性；芝麻蛋白质分子相对分子质量主要集中在20—30 kD，此类蛋白质对种子储藏蛋白具有重要意义，研究此类蛋白质性质，对芝麻蛋白加工利用具有重要意义；随着生育期的延长，芝麻种子中必需氨基酸占总氨基酸含量逐渐降低，第一限制性氨基酸随生长发育期的延长而变化，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸在氨基酸评分过程中比值系数始终大于1。

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