植物组织培养试验要点小结

陈洪燕+沈鸿云+胡双珍

摘 要：在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株。

关键词：植物组织培养；灭菌；接瓶；组培苗；移栽

中图分类号：Q943.1 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180133052

乐昌每年种植香芋1334万m2，马蹄933.8万m2，是农民种植的主要经济作物之一，香芋和马蹄都是通过留种无性繁殖，种性退化问题较为突出，抗病性和抗逆性减退，利用组织培养的方法解决品种退化问题，在许多园艺作物上都得到了成功应用，因此乐昌市农业科学研究所从今年3月开始研究植物组织培养技术，为日后组培香芋、马蹄苗做准备。现就本所组培试验要点小结如下。

1 外围准备

碟子和所有器械清洗完毕后将水擦干，用报纸捆包好，再放灭菌锅内灭菌。需灭菌的器械有：镊子、剪刀、解剖刀，碟子（8个包一包），玻璃杯2个和纱布（纱布用手撕成小块，不能用剪刀剪，否则用于擦试工作台等容易留下剪刀口布屑）。

培养基可不经过煮制，将所有物质称量好，琼脂粉等需要溶解的物质溶解，之后混合定容调pH值，再倒入灌装机分装，分装时需不停的搅拌培养基，灌装时勿将培养基滴洒在瓶口，否则需用抹布擦干净或换玻璃瓶。

灭菌锅在消毒前先预热，将夹层压力上升，减少煮制时间，煮完后手动慢慢放气（使湿热蒸汽趁热散去而不打湿防潮物）让压力下降，10min左右让室内压力降至0（避免闷锅时间长导致培养基不凝固），后取出后趁热迅速拧紧瓶盖，待冷却后移至缓冲室平放，使培养基平铺在瓶底凝固。

外植体取材：取当年生萌动状态的饱满嫩枝芽作为外植体，先用5%洗衣粉浸泡5min，用刷子轻轻刷，用流水冲洗，时间视材料清洁程度而定，蒸馏水冲洗3～5次，可去除较多泥尘和微生物，最理想的清洗物质是表面活性物质～吐温，之后将外植体切割成适当大小，灭菌容器能放入为宜，移至酒精擦试好的带盖无菌瓶子内，放入无菌操作台备用。

2 内围接瓶

将所有需要摆上无菌操作台的东西用酒精擦试表面后摆好，需用酒精擦试的物品（包括：工作台面，台周围玻璃和母瓶，新培养基瓶，酒精灯，搁置架，打火机等），母瓶和新培养基放左上方，酒精灯放左下方，身体正前方放碟子，右上方靠左放器械搁置架，右上方靠右放接种器械灭菌器，左下方放打火机和半瓶70%酒精，后开紫外灯20min，再通风20min后开始操作。

工作人员进入无菌接种室前，应先将手表、手镯、戒子等放室外，将手和手腕用肥皂清洗干净后，用酒精纱布擦拭双手、双腕，之后换工作服，包括更换拖鞋，穿白大褂，接种人员还要扎好头发，戴好帽子和口罩，指甲需剪短，将手和手臂用酒精擦试后戴手套操作，在组培室内不得高声喧哗、打闹，接种时不得随意谈话、说笑，以免造成污染，台外人员走动要轻，动作要小。

打开无菌操作台玻璃门之前先用酒精雾喷，使悬浮在无菌操作台周围的灰尘颗粒沉降，操作时将搁置架在酒精火焰上方灼烧一下，打开包装好的碟子（注意手一定不能接触碟子边沿），镊子、解剖刀从报纸取出后，先用酒精擦试一下，再放在酒精灯火焰上灼烤1遍（工具的每1点在火焰上灼烤时间不得少于5s），之后开始接（转）苗。外植体的消毒用酒精和次氯酸钠（钙），最优消毒为：既有污染的，也有消毒好没被污染的，也有褐化的。

取苗：瓶子在打开之前瓶口都需在火焰上灼烧7～10s，

正式取苗时，瓶口不要斜向外或直立向上，以免空气中微生物落入瓶中。转苗时一次取苗不可太多，以免风干。切苗：碟子放在离风窗10～20cm处，镊子和手术刀不可太热，在操作过程中，手要在碟子斜上方操作，不可在其正上方操作，更不能交叉过碟子上方操作，切苗过程中产生的垃圾堆放在碟子一侧。注意操作操作人员的头、胳膊等不得进入台内。接苗：将未接瓶的培养基瓶口在酒精灯火焰上灼烤7～10s，烤完瓶口后再接苗，接苗时，镊子不要与瓶口接触，一瓶内一般接5～6棵苗，动作迅速，组培苗在瓶内排放均匀整齐，美观。

封口、記录，接好后用酒精火焰灼烧瓶口封口，后迅速盖好瓶盖扭紧。碟子1瓶母瓶用1个，用完之后用镊子挑起拿开，接好的瓶苗随手放到无菌操作台外面推车上，工作过程中所产生的垃圾及时清理，防止交叉污染。下台前把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。接好后将工作台擦试干净，把接种过程中产生的垃圾清理掉，台上的物品摆放整齐，用消毒粉兑水拖接种室和培养室地面，后开紫外灯照射。工作人员进出组培室随手关门。培养室需密闭，避免虫子进入，室温控制在25℃左右，保证植物培养最适温度。

3 灭菌

一经发现就随即灭菌处理，大量的进行高压锅灭菌，少量的加入工业酒精在室外进行处理。室内空气灭菌：每四周用高猛酸钾和甲醛（或臭氧）对室内空气灭菌1次。室内地面：每接种1次用消毒粉兑水拖一遍地面。

4 结语

通过组织培养试验技术的研究，为日后本所香芋、马蹄的组织培养提供参考数据和技术支持，为乐昌农民提供高质量香芋、马蹄种苗，使农民获得更大的经济效益。