农作物种子转基因成分实时荧光PCR盲检技术要点与应用

辛 艳，刘 何，常雪艳，周 莹

（天津市种子管理站，天津 300061）

近年来，随着转基因农作物商品化推广进程加快，农业部和各省市种子质量监管部门下达的抽查监督检验任务都要求进行转基因成分的定性检测。因此，省级以上种子检测机构需要加快建立大批量农作物种子样品转基因检测技术平台，为转基因农作物市场监管提供技术保障。目前，实时荧光PCR定性检测法已逐步列为农业和出入境检验检疫部门的行业标准，并逐步成为各级转基因检测机构重要方法。

1 TaqMan探针技术在转基因成分检测方面应用原理

TaqMan探针技术是美国Perkin Elmer(PE)公司研制的一种实时PCR定量技术[1]。TaqMan探针技术应用于转基因成分检测，是根据使用频率最高的筛选基因即启动子、终止子等调控元件或外源基因作为检测靶标，设计特异性引物和荧光探针，在对样品DNA进行PCR扩增的过程中，实时荧光定量PCR仪根据荧光信号的积累与PCR扩增产物形成同步的关系实时监测整个PCR进程，再通过扩增曲线对检测模板DNA进行定性分析，判定样品中是否含有外源基因[2]。

2 TaqMan探针技术特点

TaqMan探针技术融汇了PCR灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱定量的准确性，将荧光标记技术、激光技术、数码显像技术融为一体，具有特异性和准确性强、灵敏度高、假阳性低、重复性好、定量范围宽、检测效率高等特点。另外，实时定量PCR仪操作简单、安全、自动化程度高，PCR扩增和检测在全封闭的同一反应管内进行，能有效减少核酸扩增产物的交叉污染，而且扩增和检测一步完成，不需要电泳等PCR后期处理，更避免了电泳染色剂EB、放射性同位素或挥发性有害物质如甲醛等对检测人员的伤害[3]。

目前，我国针对已批准的转基因农作物品种中使用频率最高的调控元件，如启动子CaMV35S、终止子NOS及通用于多种主要农作物的抗虫基因Cry1Ab/c、耐除草剂基因EPSPS等，设计出30多对特异性引物和相应的荧光探针，陆续建立了多种农作物转基因成分实时荧光PCR检测方法的行业标准。该方法可快速准确地检测出国内外主要商品化转基因品种，涉及主要农作物包括玉米、大豆、水稻、油菜、棉花等。表1是出入境检验检疫行业标准中转基因作物的主要筛选基因[2，4-7]。

表1 出入境检验检疫行业标准中玉米、大豆、水稻、油菜、棉花的筛选基因

3 TaqMan探针技术检测转基因成分技术流程与操作要点

3.1 样品预处理

检测样品前要充分混匀，根据样品特性选择研磨方式。淀粉类种子如玉米种子取20粒，水稻种子30～40粒，直接用球磨仪或组织研磨仪研磨；含油成分较高的如棉花、油菜等可在研磨的样品中加入1 mg左右的硼砂，防止样品在研磨中粘在一起。还可将种子培养至发芽，取发芽的第一叶部分用液氮研磨。

样品的预处理过程中应注意研磨罐或研磨坩埚及取样器具每用一次必须清洁干净且干燥，确保无任何污染、样品间的机械混杂及样品组分的改变。

3.2 DNA提取及其质量测定

选择CTAB法、SDS法、试剂盒法都是行业标准推荐的DNA提取方法。对于大批量农作物种子样品，既要在有限时间内完成任务又要保证DNA提取质量，采用DNA提取试剂盒法是符合要求的好方法。该方法污染较少，效率高，提取浓度在20～100 ng·μL-1，3 h內可提取20～30个样品的DNA。CTAB法和SDS法可获取较高浓度的DNA，但这两种方法提取时间长，效率低，易污染，且要用到易挥发的有毒试剂，不适合大批量样品提取。

DNA质量的检测可以用琼脂糖凝胶电泳法、紫外分光光度计和超微量紫外分光光度计来测定。高质量的DNA在琼脂糖凝胶电泳上显示的是清楚明亮的单一条带，如果出现弥散拖尾的条带则说明DNA质量不好或有降解。使用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，比用琼脂糖凝胶电泳法更加便利，迅速，检测结果直观。稀释部分DNA，测定并记录其在260 nm和280 nm的紫外吸收率。以一个OD260相当于50 μg·mL-1DNA浓度来计算DNA浓度。以OD260/280值表示DNA样品纯度。OD260/280值在1.7～2.0说明DNA纯度较好；若OD260/280值小于1.7可能有蛋白质残留，也可能是用去离子水洗脱的原因；若OD260/280值大于2.0，可能有RNA污染或DNA降解。

3.3 平行样与对照的设置

检测样品设2个平行样；每次检测必须设立3个对照，一是阳性目标DNA对照，为可溯源的标准物质提取的DNA；二是阴性目标DNA对照，为非转基因农作物样品DNA；三是试剂空白对照（不含DNA模板）。同时检测内源基因，每次检测要设立3次重复。

3.4 检测流程

转基因成分的检测对象包含启动子、终止子、外源目的基因或标记基因事件。对大批量种子样品的转基因成分定性检测，先进行启动子和终止子的筛查，筛查结果为阳性的样品再进行功能基因或标记基因的筛查。例如，转基因玉米的定性筛查，只要检测启动子P-CaMV35S，终止子T-NOS，筛查率就可达99%。考虑到功能基因的分布，加上 BAR、PAT、NPTII、Cry1Ab/c、gat等元件，转基因玉米的检测覆盖率可达2次以上，大大降低漏检风险。

3.5 引物和探针浓度要求

引物和探针的浓度影响反应的特异性。引物和荧光探针按照行业标准公布的序列购置，按照产品说明用TB缓冲液或去离子双蒸水配制成100 μmol·L-1母液保存于-20 ℃，应用时引物配制成10～20 μmol·L-1工作液，探针配制成5～10 μmol·L-1工作液。荧光PCR反应的引物终浓度为0.1～0.6 μmol·L-1，探针终浓度为0.05～0.30 μmol·L-1。体系中引物与探针浓度低会导致反应不完全，浓度高则会产生非特异性产物。

3.6 荧光PCR缓冲液的要求

荧光PCR反应最好使用市售的专用qPCR混合液。一般专用qPCR混合液是2倍浓度；荧光PCR反应体系要求的终浓度为1倍。如果自行配制qPCR体系混合液，25 μL体系中，PCR缓冲液终浓度为1倍，dNTP终浓度为0.2 mmol·L-1，浓度过低会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低，进而影响Taq酶发挥最佳活性；Mg2+终浓度为2.5 mmol·L-1，Mg2+的浓度高会增加非特异性扩增；Taq酶终浓度为2.5 U,浓度高也可引起非特异性扩增，浓度低则合成产物量减少。

3.7 模板DNA浓度

模板DNA的质量会影响PCR扩增的效率。最初提取较高浓度的DNA母液应在-20 ℃保存，避免反复冻融。稀释部分DNA，以浓度20～50 ng·μL-1作为工作液分管保存，用TE缓冲液溶解和稀释模板DNA能延长保质期。在25 μL体系中，模板DNA浓度在20～50 ng·μL-1下，取2.0～4.0 μL均可扩增出相应产物。

3.8 实时荧光PCR反应的条件设置

转基因筛选实时荧光PCR的参数设置条件依仪器不同稍有改变，一般为50 ℃ 2 min，95℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。引物与探针的退火温度极其重要。一般探针的退火温度（Tm值）比引物高10 ℃。经实验研究发现，适宜的退火温度为55～60 ℃，以确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。转基因筛选实时定量PCR反应一般设置为25～40个循环。只有极微量的待测样本，适当增加循环数以提高反应的检出底限，可以将循环数增加至45。实际上，当循环数增加到某一值时，反应曲线趋于平线，不再升高。

3.9 实时荧光PCR仪操作要点

3.9.1 反应板的设置

3.9.2 上样操作

3.1 0 实时荧光PCR结果分析

实时荧光PCR的结果的判断首先要设置无效基线范围。基线范围选择在3～15个循环，与荧光通道无关。人为设置的荧光信号阈值（Ct值），原则上要大于样本的荧光背景值和阴性样品扩增曲线的最高值，同时尽量选择进入指数期的最初阶段。农作物转基因成分检测Ct值为一般以40为准。

內源基因的检测是可以验证PCR反应体系中是否存在抑制物质，以避免检测结果的假阳性。不同农作物实时荧光PCR方法的行业标准，其內源基因检测Ct值规定不同。以转基因玉米检测为例，內源基因检测的临界值为24。內源基因检测Ct值均小于或等于24时，当设置的阴性与空白对照结果正常情况下，待测样品每个重复检测的Ct值均小于或等于36，判定该样品检出外源基因；待测样品各重复的Ct值大于或等于40，判定该样品未检出外源基因；如果待测样品各重复的检测Ct值在36～40之间，需要重做，并考虑调整模板DNA加入量。再次扩增后在设置的各对照结果均正常情况下，待检样品Ct检测值仍小于40，则可判定该样品检出外源基因；Ct检测值大于40，则可判定该样品未检出外源基因[4]。

Ct值的大小还与模板DNA的浓度相关。适宜的DNA模板量是内源基因检测的Ct值在15～36之间，外源基因的检测Ct值在27～36之间。Ct值小于15时，应减少模板DNA量；而Ct值超过40时，表明PCR过程中没有目标DNA扩增；在Ct值在36～40之间时，且各平行样的检测结果差异很大，说明模板DNA在PCR反应体系中的含量很少，需要增加模板量或提高模板DNA浓度[4]。

4 多重荧光PCR技术在转基因元件筛查方面的探索

多重荧光PCR是对多个（1个以上）目的基因同时做荧光PCR检测。设计多重荧光PCR要考虑五个因素， 一是特异性引物和探针的组合要求。所设计的引物退火温度Tm值接近相同（55～60 ℃），相应的探针的Tm值接近相同，约高于引物Tm值5～10 ℃，且不同引物及探针之间不能互补。建议用Beacon Designer、Primer Premier 5.0或 Oligo 6.72 软件设计多重反应的引物与探针组合；二是多重荧光PCR实验要求使用多个报告基团来追踪每个靶标的扩增反应，为区分每个反应，应选择发射波长最小限度重叠的荧光报告基团；三是多重荧光PCR反应要求的模板DNA的浓度和纯度较高，浓度要求在150～300 ng·uL-1,纯度要求在1.8～2.0之间。普通DNA提取试剂盒所提取的DNA达不到要求，使用改良的CTAB[8]法会得到较高浓度和纯度的DNA；四是多重荧光PCR体系最好专用qPCR混合液，因为其缓冲液、DNA聚合酶及dNTP的配比良好，还具有PCR反应的增强剂和稳定剂，可以提高反应效率。五是建立多重实验的先要优化单重引物/探针反应，使其扩增效率达到90%以上；然后在同一反应板上进行靶序列的单重和多重试验，如果单重与多重的靶序列Ct值差异不明显，则说明体系中各成分加量合适，反之则需要优化反应，通过调节反应预混液、引物/探针、模板DNA的加入量来实现。

多重荧光PCR技术在病原菌检测、病毒检测方面的应用报道较多，在转基因成分定性与定量检测方面的报道还不多。董进法[9]设计了P-35S和T-NOS多重荧光PCR体系，成功将转基因大豆与非转基因大豆分开；刘光明等[10]也设计出了35S启动子和NOS终止子的双重特异性引物，利用多重荧光PCR同时检测了大豆、玉米、马铃薯、番茄等11份样品中的CaMV35S和NOS转基因成分。付伟等[11]针对大豆內源基因Lectin和转基因大豆DAS44406-6品系的5’端插入序列设计特异性引物及探针，建立了同时检测大豆內源基因Lectin和转基因大豆DAS44406-6品系的双重荧光定量PCR方法并运用于15种转基因大豆和非转基因大豆的特异性评价，其灵敏度达到0.01%。可见实时荧光多重PCR在转基因定性与定量方面值得进一步研究和推广。

5 实时荧光PCR技术展望

利用实时荧光PCR检测方法对大量盲样进行筛查，既提高检测效率，又降低检测成本，而且准确性高，该方法可广泛用于农作物种子质量监督抽查大批量盲样的转基因成分检测。但越来越多的转基因作物采用全新的启动子、终止子和标记基因，利用已公布的引物和探针做检测就会有一定的局限性，这就需要不断开发新型的特异性引物和荧光探针，将来转基因成分筛查基因也会更多。若该技术与生物芯片、免疫磁珠、色谱技术、光谱技术和微解剖技术[12]等各类技术联合开发使用，实时荧光PCR技术在转基因成分检测方面的应用前景必将越来越广阔。

[1]袁继红.实时荧光定量PCR技术的实验研究[J].现代农业科技，2010（13）：20-22.

[2]中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2584—2010 水稻及其产品中转基因成分实时荧光检测方法[S].

[3]许安君.实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用[J].粮油食品科技，2013（2）：68-70.

[4]中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，SN/T1196—2012 转基因成分检测 玉米检测方法[S].

[5]中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，SN/T1197—2016 油菜中转基因成分 普通PCR法和实时荧光检测方法[S].

[6]中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，SN/T1199—2010棉花中转基因成分定性检测方法[S].

[7]中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，SN/T 1195-2003 大豆中转基因成分的定性PCR检测方法[S].

[8]Markus L, Peter B, Klaus P, et al.IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder[J] .Journal of AOAC International,1999, 82(4)∶923-928.

[9]董进法.转基因生物多重荧光PCR检测体系的建立[D].福建：福建农林大学，2007.

[10]刘光明，李庆阁，王群力，等.多重荧光 PCR同时检测转基因成分 35S和Nos 方法的建立[J].厦门大学学报，2002，21（4）：379-383.

[11]付伟，任娇，魏霜，等.转基因大豆 DAS44406-6多重荧光定量 PCR 检测方法的建立[J].食品工业科技，2017（4）：63-66.

[12]Swan D C, Tucker R A, Holloway B P, et al . A sensitive,type- specific , fluorescence genic probe assay for detection of human papillomavirus DNA[J]. Clin Microbiol, 1997, 35( 4) ∶886-891.