磺胺二甲嘧啶对斑马鱼胚胎的急性毒性作用

刘丽丽，吕鹏，闫艳春

(1.中国农业科学院研究生院， 北京 100081； 2.北京市水产科学研究所，水族技术研究室， 北京 100068)

近年来，全球各地自然环境中频繁检测到抗生素的痕迹，这些抗生素大多数为人用非处方药、兽用抗生素和饲料添加剂，消费使用量大，排放时间持久，在环境中广泛存在，其对于非靶标生物特别是水生生物的毒性作用逐渐受到重视。以中国为例，2013年全国36种常用抗生素总消耗量约为92 700 t，其中54 000 t抗生素经由人类和动物排泄到体外，经过各种污水处理系统，最终53 800 t抗生素进入自然环境中[1]。在各种抗生素污染物中，磺胺类是在水体环境中检出频率和检测浓度较高的抗生素污染物之一，典型的磺胺类污染物磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine，SMZ)在德国地下水中的质量浓度最高为0.16 μg/L[2]，在美国主要河流中的平均质量浓度为2.2 μg/L[3]，湄公河三角洲地区地表水中质量浓度高达19.2 μg/L[4]。由于磺胺类抗生素大量用于畜牧业和渔业生产，磺胺污染物在养殖场和污水排放口等环境中的检测浓度可能更高[5]。

磺胺类污染物对水生植物和低等生物表现出不同程度的毒性作用。例如，质量浓度为mg/L级的磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)急性暴露能够抑制水生无脊椎动物和藻类生长[6]；浓度为μmol/L级的磺胺胍(sulfaguanidine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)等磺胺类抗生素长期暴露会导致低等水生动物存活率显著下降[7]。当前研究主要集中于抗生素类污染物的环境行为及其对水生植物和低等动物的发育毒性作用，而抗生素污染物对水生脊椎动物，特别是鱼类的发育毒性，则鲜有报道。因此，本研究以脊椎动物模式生物斑马鱼胚胎为受试对象，参照OECD 236指导文件关于鱼类胚胎急性毒性试验(fish embryo toxicity test，FET)方法，研究以SMZ为代表性药物的磺胺类污染物对其的急性毒性。通过分析SMZ对斑马鱼胚胎的暴露时间-致死率曲线和药物浓度-致死率曲线，分析SMZ对斑马鱼胚胎死亡率、孵化率的影响和SMZ对斑马鱼胚胎发育的致畸效应，从而确定SMZ的毒性参数和毒性效应，评价SMZ对鱼类的急性毒性作用，为抗生素污染物对鱼类安全的影响提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

磺胺二甲嘧啶钠(sulfamethazine sodium, Cas 1981-58-4，Lot 4QCTD-00)购买自东京化成工业株式会社，纯度>97.0%。甲醇、NaCl、NaHCO3等常规有机化学试剂和无机化学试剂购买自国药集团化学试剂有限公司，其中甲醇、磷酸二氢钾等用于高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析的试剂纯度为色谱纯。

仪器主要包括：斑马鱼独立养殖系统(北京爱生科技发展有限公司)、高效液相色谱(Agilent 1200)、恒温光照培养箱(上海一恒科技有限公司)、体视显微镜(Leica EZ4 HD)、倒置显微镜(Olympus IX2)、超纯水仪(Millipore)、电子天平(Mettler Toledo)、滤膜(津腾实验设备有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物

野生型AB品系斑马鱼购于国家斑马鱼资源中心(武汉)，在本实验室进行饲养繁殖，实验过程严格遵守动物伦理学操作规范。毒理实验以96 hpf(hours post fertilization)内的斑马鱼胚胎为受试动物，是因为斑马鱼胚胎(<120 hpf)不具有感知疼痛的能力，胚胎实验不受到动物福利相关法规的限制[8]。斑马鱼养殖条件为：独立养殖系统饲养繁殖斑马鱼，自动照明系统保持光照/黑暗(14 h/10 h)循环，冷热两用空调保持室温(28±0.5)℃，排风扇定时排除室内水气，避免湿度过大；水循环系统使用处理后的自来水，即经过除杂、除氯、净化和紫外消毒，添加NaCl和NaHCO3，保持电导率为500～550 μs/cm，pH 为7.0～7.5；废物处理系统自动过滤鱼的粪便和剩余鱼食，废水排出后自动补充新鲜养鱼水。每日喂食新鲜丰年虾2次。

1.2.2 溶液配制与HPLC检测

将100 mg磺胺二甲嘧啶钠粉末溶解于100 mL E3 buffer缓冲液(5 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.33 mmol/L MgSO4)，配制成1 g/L储液，避光保存于4 ℃。使用时稀释至工作浓度(0.001、 0.01、 0.1、 1、 10、 100、 300、 500、 700和1 000 mg/L)，通过HPLC检测并确认其浓度。HPLC检测方法参见文献[9]，具体为：以甲醇-磷酸二氢钾溶液(35∶65，V/V)为流动相，检测波长210 nm，Promosil C18柱(250mm×4.6mm，5μm，100 Å)为分离色谱柱。其中，磷酸二氢钾溶液配制方法为取KH2PO413.6 g，加适量去离子水溶解，用2% KOH溶液调pH至5.3，继续加去离子水定容至1 000 mL。设置流速为1 mL/min，进样量为2 μL。样品上机前先进行25 000 g离心5 min，并用0.22 μm滤膜过滤。

1.2.3 胚胎急性毒性实验

实验开始前一天下午，挑选健康、发育一致的成年斑马鱼(10月龄)，按照雌雄比例1∶1转移到配鱼盒内，用隔板隔开，配鱼盒环境条件与斑马鱼养殖条件一致。次日光照开始后，抽隔板，斑马鱼开始追尾交配，30 min后收集受精卵。受精卵用E3 buffer轻轻清洗两次，在显微镜下挑选成功受精、发育阶段一致的受精卵，用于毒性暴露实验。胚胎毒性实验在OECD 236指导文件[10]的基础上进行了改进。实验共设置1个对照组(E3 buffer组)和10个处理组，处理组分别为0.001、 0.01、 0.1、 1、 10、 100、 300、 500、 700和1 000 mg/L SMZ溶液。每组60个胚胎(n=60)，所有实验进行3次生物学重复。胚胎在3 hpf前转移到6孔板内，每孔10个胚胎、15 mL处理液。6孔板在28 ℃恒温培养箱内静置培养，14 h/10 h光照黑暗循环，每隔24 h更换2/3体积的处理液，胚胎发育至96 hpf时停止暴露处理。SMZ溶液使用时用E3 buffer稀释到工作浓度，并预温至28 ℃，暴露实验前后都进行HPLC检测，确保试剂实际浓度在理论浓度±20%范围内[11]。

1.2.4 显微镜观察与死亡、孵化胚胎数量统计

暴露过程中，体视显微镜统计12、 24、 48、 72、 96 hpf死亡胚胎数和48、 72、 96 hpf孵化胚胎数，Origin Pro 8.0进行数据分析；倒置显微观察并记录胚胎发育过程中出现的畸形现象。以胚胎心脏停止跳动为毒理学死亡终点。死亡率(%)=死亡胚胎数/60×100，孵化率(%)=孵化胚胎数/60×100。

1.3 数据统计与分析

Origin Pro 8.0进行初步数据统计分析和绘图，Levene test检验方差齐性，单因素方差分析(one-way ANOVA)确定数据显著性。所有数值均用平均值±标准误差(n=3)表示，P<0.05表示为有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 SMZ暴露浓度对斑马鱼胚胎死亡率的影响

统计梯度浓度SMZ溶液和对照组(E3 buffer)暴露条件下，斑马鱼胚胎在12、 24、 48、 72和96 hpf的死亡率，使用Origin Pro 8.0软件进行数据分析，获得梯度浓度SMZ暴露对不同发育阶段斑马鱼胚胎死亡率(图1)，发现低浓度SMZ(0.001～1 mg/L)暴露对斑马鱼胚胎的死亡率没有显著影响，中等浓度SMZ(10～300 mg/L)暴露导致斑马鱼胚胎死亡率显著降低(P<0.05)，而高浓度SMZ(500～1 000 mg/L)导致斑马鱼胚胎死亡率显著上升(P<0.05)。

研究表明，在一定浓度范围内，SMZ降低了斑马鱼胚胎的死亡率，当浓度高于500 mg/L时，SMZ诱导斑马鱼胚胎死亡率上升，对斑马鱼生长发育表现出毒性作用。本研究发现，不同浓度SMZ对斑马鱼胚胎生长表现出完全相反的作用，谢美萍等[12]对斑马鱼成鱼肝脏谷胱甘肽S转移酶(GST)活性的研究得到相似的结论：低浓度磺胺类抗生素能够诱导斑马鱼肝脏GST的表达，而高浓度磺胺则抑制肝脏GST水平。因此我们推测，SMZ对斑马鱼表现为毒物兴奋效应(hormesis)，即在低浓度时表现为刺激效应，高浓度时表现为抑制效应[13]。当浓度≥10 mg/L时，SMZ处理组96 hpf累计死亡率与对照组有显著差异(P<0.05)。因此，以死亡率为指标，SMZ对96 hpf斑马鱼胚胎的效应浓度大约为10 mg/L，低于此浓度时，处理组与对照组胚胎死亡率无显著变化(图1)。

研究发现，SMZ对斑马鱼胚胎的致死毒性比较小，当SMZ浓度达到1 000 mg/L时，其96 h致死率仅为28%左右，实验未检测到SMZ对斑马鱼胚胎的96 h半数致死浓度。考虑到环境中SMZ实际浓度范围，我们认为在实验中继续升高SMZ浓度没有实际意义，因此不进行更高浓度组实验。

2.2 SMZ暴露时间对斑马鱼胚胎死亡率的影响

随着SMZ暴露时间延长，斑马鱼胚胎死亡率逐渐上升。当暴露至12 hpf时，胚胎死亡率开始表现出剂量差异：10～300 mg/L SMZ处理组死亡率低于对照组，而700～1 000 mg/L SMZ处理组死亡率高于对照组。当暴露时间延长至24 hpf时，10～300 mg/L SMZ处理组累计死亡率仍低于对照组，而1 000 mg/L SMZ处理组累计死亡率高于对照组。随着暴露时间进一步延长，10～300 mg/L SMZ处理组累计死亡率趋于稳定，700～1 000 mg/L SMZ处理组累计死亡率随着暴露时间延长继续上升，表现出时间依赖性(图2)。

图1 梯度浓度SMZ对斑马鱼胚胎的致死率的影响*表示与对照组相比，有显著差异，P<0.05。下同。Fig.1 Effects of gradient SMZ on mortality rates of zebrafish embryos(n=3)* represents significant difference compared to control group,P<0.05.The same below.

图2 SMZ诱导的斑马鱼胚胎死亡率随时间的变化趋势Fig.2 Time-dependent mortality rates of zebrafish embryos exposed to SMZ

2.3 SMZ暴露浓度对斑马鱼胚胎孵化率的影响

孵化是斑马鱼胚胎发育的重要阶段，只有完成胚胎孵化，幼鱼才能开口进食和自由游动。如果胚胎不能打破绒毛膜的屏障，顺利完成孵化，最终会死亡。孵化是生理、生化和渗透机制共同作用的结果[14]，斑马鱼胚胎孵化通常开始于48 hpf，到72 hpf时胚胎全部孵化完成[8]。

本研究统计了梯度浓度SMZ对斑马鱼胚胎孵化率的影响，发现随着SMZ暴露浓度的增加，48hpf胚胎孵化率表现出先上升后下降的趋势(图3)，具体表现为：当SMZ浓度低于0.1 mg/L时，胚胎孵化率与对照组相比没有显著变化；当浓度为1～700 mg/L时，胚胎48 hpf孵化率显著高于对照组(P<0.05)，并且当SMZ暴露浓度为100 mg/L时，48 hpf孵化率最高；当SMZ浓度进一步升高，达到1 000 mg/L时，48 hpf孵化率显著低于对照组(P<0.05)。研究表明，当以胚胎48 hpf孵化率为毒性参数时，SMZ的效应浓度为1 mg/L；当SMZ浓度为1～700 mg/L时，能够促进斑马鱼胚胎孵化，而当SMZ浓度进一步升高时，对斑马鱼胚胎孵化具有抑制作用。

图3 梯度浓度SMZ暴露条件下斑马鱼胚胎孵化率Fig.3 Hatching rates (%) of zebrafish embryos exposed to gradient SMZ

孵化既是斑马鱼胚胎发育的一个关键时期，也是评估化学物质对鱼类作用的一个主要毒理学终点[10]。研究发现，不同的化学物质对斑马鱼胚胎孵化过程的作用各不相同，2,4-二羟基二苯醚(HODE-15)、4,4′-二氟二苯醚[15](FDE-15)和散沫花染料(henna)[16]等物质会显著降低斑马鱼胚胎孵化率；而联苯菊酯、苯并(a)芘和乙酸三苯锡能够促进斑马鱼胚胎孵化过程[17]。据文献报道，胚胎孵化一方面是由于孵化酶(hatching enzyme)消化绒毛膜，另一方面是由于胚胎物理性运动产生的机械力会撕破绒毛膜，渗透机制可能也参与了这一过程[18]。

因此我们推测，本研究中SMZ促进和抑制胚胎孵化的现象是多种生理生化机制共同作用的结果。低浓度SMZ促进孵化而高浓度SMZ抑制孵化的现象说明SMZ对斑马鱼可能具有毒物兴奋效应。

2.4 SMZ暴露对斑马鱼胚胎发育的致畸效应

本研究发现，SMZ暴露导致斑马鱼胚胎发育畸形，包括斑马鱼胚胎脊柱弯曲(图4B)、心包囊肿(图4B)、色素生成增加(图4B)、尾部缺失(图4C)、躯干发育不全(图4D)等。本研究中，当SMZ浓度为10～1 000 mg/L时，48 hpf和72 hpf都观察到明显的畸形胚胎，说明SMZ对斑马鱼胚胎的致畸效应开始于48 hpf以前，而在以往文献报道中，通常在72 hpf及以后观察到化学物质诱导的致畸现象[19]。可以推测，SMZ对斑马鱼胚胎早期发育(48 hpf以前)具有严重的致畸性。48 hpf是胚胎开始孵化的时期，在此阶段之前胚胎被绒毛膜包被，受到绒毛膜的保护，本研究表明，绒毛膜屏障不能保护胚胎免受来自SMZ的毒性作用。

图4 SMZ诱导的斑马鱼胚胎发育畸形(放大倍数：2.5×16)(A)72 hpf对照组；(B)72 hpf，0.001 mg·L-1 SMZ处理组；(C)48 phf，1mg·L-1 SMZ处理组；(D)48 hpf，10 mg·L-1SMZ处理组。Fig.4 Teratogenesis images of zebrafish embryos exposed to SMZ(Magnification: 2.5×16)(A) 72 hpf(control);(B) 72 hpf treated with 0.001 mg·L-1 SMZ(C) 48 hpf treated with 1 mg·L-1 SMZ;(D)48 hpf treated with 10 mg·L-1 SMZ.

胚胎畸形如心包囊肿和尾部弯曲是常见的毒理学终点[20]，通常与毒性物质的分子靶标相关，因此具有高度敏感性。胚胎畸形现象通常作为药物非致死效应的主要指标之一，在毒性评价中具有重要的意义，有利于分析药物对机体造成的神经肌肉、生理、表观或行为损伤，确定药物对胚胎发育的影响。

本研究还发现，0.001 mg/L暴露72 h会导致斑马鱼胚胎严重畸形现象，说明当以致畸效应作为毒性参数时，SMZ对72 hpf斑马鱼胚胎的效应浓度为0.001 mg/L，远低于以死亡率为毒性参数时的效应浓度，而接近SMZ在水体环境中的实际检测浓度。可见，与致死效应相比，SMZ对斑马鱼胚胎的致畸效应更显著。下一步，我们将明确SMZ对斑马鱼胚胎致畸的剂量效应，探索SMZ致畸的分子机制，深入分析SMZ对斑马鱼胚胎发育的毒性作用，从而预测低浓度SMZ对鱼类胚胎发育的致畸效应，为相关水质标准的制定提供数据支持。

3 结论

以死亡率为毒性参数，SMZ对96 hpf斑马鱼胚胎的效应浓度为10 mg/L；10～300 mg/L SMZ有利于提高斑马鱼胚胎存活率；当浓度高于500 mg/L时，SMZ诱导斑马鱼胚胎死亡，对斑马鱼生长发育表现出毒性作用。500 mg/L SMZ对斑马鱼胚胎的致死效应主要发生于48 hpf内；当浓度≥700 mg/L时，SMZ对斑马鱼胚胎的致死效应具有时间依赖性。

当以孵化率为毒性参数时，SMZ对48 hpf斑马鱼胚胎的效应浓度为1 mg/L；1～700 mg/L SMZ促进48 hpf斑马鱼胚胎孵化；而1 000 mg/L SMZ对斑马鱼胚胎孵化具有抑制作用。

当以致畸效应为毒性参数时，SMZ对斑马鱼胚胎的效应浓度为0.001 mg/L；SMZ对斑马鱼胚胎具有致畸效应，诱导胚胎发育过程中出现脊柱弯曲、心包囊肿、色素生成增加、尾部缺失、躯干发育不全等畸形现象。

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