温经汤调节HER-2阳性乳腺癌术后患者阴阳平衡及对PD-1/PD-L1的影响

郑 琎 傅春燕 陈述政

乳腺癌是女性常见的发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，全球每年乳腺癌发病人数有135万左右，死亡人数约33万[1]，尤其是2012年，其发病人数高达170万，且死亡人数高达52万[2]。在临床医学手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等手段下，仍为当前危害女性健康的头号杀手。按照2007年发表于柳叶刀肿瘤学杂志分型法[3]，将乳腺癌分 为 LuminalA、LuminalB、HER-2positive 和Basal-like 4种亚型。曲妥珠单抗为第一个靶向治疗HER-2（人类表皮生长因子受体-2）的人源性单克隆抗体，具有调控细胞生长因子信号传导途径等作用成为乳腺癌靶向治疗的基石，在HER-2阳性乳腺癌患者辅助治疗中有着重要地位[4]。肿瘤免疫逃逸机制使得免疫治疗已成为当前研究重点，笔者应用温经汤研究中医“阴阳平衡”对HER-2阳性的乳腺癌患者机体免疫紊乱的调节作用，现报道如下。

1 临床资料

选取本院2011年1月—2013年12月HER-2阳性乳腺癌手术后患者共65例，均为女性，分为治疗组 33例，年龄 28～74岁，平均（43.5±16.5）岁，平均病程（6.4±3.7）年；对照组 32例，年龄 27～76岁，平均（42.3±17.3）岁，平均病程（5.9±3.1）年。两组患者年龄及病程等一般资料方面差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。患者均知情同意且签署知情同意书，经过医院伦理委员会批准后实施。两组患者诊断标准参考2011年版《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范》[5]。中医诊断标准参考《中医病证诊断疗效标准》[6]，符合下焦虚寒、阴阳失调证型。均为HER-2阳性 [标准免疫组化（IHC）+++，或原位荧光杂交法（FISH）阳性；免疫组化检测显示 HER-2（+++），可以直接判断为HER-2阳性；FISH检测，比值＞2.2则可判断为HER-2阳性]，及左心室射血分数（LVEF）＞60%者。

2 方法

治疗组予曲妥珠单抗联合中药“温经汤”治疗，对照组给予曲妥珠单抗治疗。曲妥珠单抗周疗剂量为2mg/kg（首次剂量为4mg/kg），或3周1次剂量为6mg/kg（首次剂量为8mg/kg），共1年。“温经汤”组方：吴茱萸 9g（先煎 30min），桂枝 5g，川芎 6g，当归12g，白芍 9g，丹皮 12g，干姜 3g，麦冬 20g，清半夏10g（水洗），党参 15g，生甘草 6g，东阿胶（烊化）、重楼各9g。1天1剂，加入700mL饮用水，浸泡30min，自动煎药机煎煮，文火煎煮40min，液体包装机灌装每袋150mL，1天2袋，空腹或餐后1～2h口服。患者每周取药1次。两组其他综合治疗均一致，总治疗周期均为48周。

观察指标：检测两组患者治疗前、治疗后第24周、48周的血常规、肿瘤指标，外周血程序性死亡因子（PD-1）、程序性死亡因子配体-1（PD-L1），外周血IL-17，心脏彩超，常规B超；记录每位患者治疗前和治疗后第24周、48周的中医证候，以“八纲”为目，由副主任及以上中医师辨别表里、寒热、虚实；若左心室射血分数（LVEF）较治疗前绝对数值下降≥16%或者LVEF＜正常范围并且较治疗前绝对数值下降≥10%，应停止曲妥珠单抗治疗；若4～8周内LVEF回升至正常范围或LVEF较治疗前绝对数值下降≤15%，可恢复使用曲妥珠单抗。LVEF持续下降（＞8周），或者3次以上因心肌病而停止曲妥珠单抗治疗，应永久停止使用曲妥珠单抗。常规B超提示有远处转移证据，则按2011年指南相应措施规范化治疗。

血常规检测采用全自动生化分析仪及配套试剂（编号E1003）；IL-17检测：取清晨空腹外周静脉血5ml，EDTA 抗凝，离心机 4000r/min，离心 5min，分离血浆后，置于零下20℃冰箱冻存，采用酶联免疫吸附法（ELISA），严格按照试剂盒说明书操作。PD-1/PD-L1表达水平检测：取3支专用流式管，分别加入抗人CD4-FITC抗体10μL和MouseIgG1-PE同型质控2.5μL、抗人CD4-FITC抗体10μL和抗PD-1-PE抗体2.5μL、抗人CD-FITC抗体10μL和抗人B7-H1-PE抗体2.5μL，然后每管各加入全血50μL，混匀，避光15min后加入1mL溶血剂，室温放置10min，1500r离心，5min弃上清，再分别加入1mL生理盐水，混匀，1500r离心，5min弃上清，最后加入500mL生理盐水重悬细胞，上流式细胞仪（美国BECKMANCOULTE公司）检测。采用FS-SS参数分析基础上，对全PBMC设门，设定CD4阳性细胞门，检测CD4+T细胞上PD-L1/PD-1的表达水平，并扣除同型对照的非特异性本底值。

统计学方法：应用SPSS19.0统计软件进行数据统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组间计量资料比较采用t检验；计数资料采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

治疗过程中治疗组有3例LVEF第4周持续下降，对照组1例持续下降，1例锁骨上淋巴结肿大而更改方案治疗，最终两组各30例入组数据分析。

3.1 两组外周血PD-1表达水平比较 治疗前两组PD-1差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后两组PD-1均不同程度下降，治疗48周后，治疗组PD-1低于对照组，与治疗前和对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

3.2 两组外周血PD-L1表达水平比较 治疗前两组PD-L1差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后两组PD-L1均不同程度下降，治疗48周后，治疗组PDL1低于对照组，与治疗前和对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

3.3 两组WBC、RBC、PLT比较 治疗前两组患者白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，治疗组患者WBC计数与治疗前相比有所升高，对照组反而稍有下降，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；两组RBC和PLT比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 3。

表2 两组HER-2阳性乳腺癌患者血 PD-L1表达水平比较[例（%）]

表3 两组HER-2阳性乳腺癌患者WBC、RBC、PLT比较（×109/L，x±s）

3.4 两组外周血IL-17表达水平比较 治疗前两组IL-17差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后两组IL-17均不同程度下降，但对照组治疗前后比较差异无统计学意义（P＞0.05），治疗组治疗48周与治疗前及对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 两组HER-2阳性乳腺癌患者血IL-17表达水平比较（pg/mL，x±s）

3.5 两组“八纲”条目比较 治疗组治疗前后“里虚寒”患者构成比由36%下降到13.7%，对照组“里虚寒”构成比由37%下降到26%，治疗组疗效更显著，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 5。

3.6 两组安全性指标比较 治疗过程中，两组均未见明显不良反应，与对照组治疗后比较，两组在心超、心电图、B超、尿常规等方面差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 6。

4 讨论

根据乳腺癌发病的四诊内容，参考历代医家文献，乳腺癌可以归于“乳岩”、“乳石痈”、“石榴”、“乳栗”等病证，历代医家对乳岩的病因、病机、症候及证治具有独到的见解。《难经》曰：“积者，阴气也，其始发有常处，其痛不离其部，上下有所终始，左右有所穷处。”《黄帝内经》曰：“任脉为病，女子带下癓瘕。”[7]任脉在女子诸病尤其是积病上至关重要。《金匮要略·妇人杂病脉证并治》言：“妇人年五十，暮即发热，少腹急，腹满，手掌烦热，唇口干燥，何也？师曰：此病属带下，瘀血在少腹不去，当以温经汤主之。”[8]温经汤亦主妇人少腹寒，久不受胎；兼取崩中去血，或月水来过多，及至期不来。该方是一张调任脉的祖方，堪称女科第一方，此“带下”之病机乃属地道不通，厥阴虚寒，水不生木，任脉失交与阳明土和厥阴木，故主任脉也。“温经汤”方意可理解为合“吴茱萸汤”、“桂枝汤”、“胶姜汤”、“麦门冬汤”、“桂枝茯苓丸”而成一方。“桂枝汤”为群方之冠，外调营卫气血，内调七情之杂病，桂枝汤为升厥阴肝木的第一要法。肝藏血，血得温乃升，桂枝性温，白芍濡养肝木，当归助肝藏血。地道不通，水生木，肾水竭，补天道生水，故真水只能由脾胃生化而来，因此用了吴茱萸汤和麦门冬汤，这便是“一气周流”。厥阴肝木不能升达，少阳相火不降，则阳明不能降，是故手掌心热，所以用半夏，麦冬来降阳明土。相火下耗肾水，上则口干口苦，发枯经闭，精血横溢，月经淋漓不尽，不得有子，少腹急，厥阴肝木不能达，小腹满，脾气不能升达。女子以血为主，任脉、厥阴肝都是以血濡养的经脉，阳明经亦是多血多气之经，而任脉下系肝肾上系阳明，三经皆布散于口唇，因此嘴唇干瘪干燥，是女子血亏的第一表现。正如《内经》言：“二八女子，唇红齿白。”气血充盈是也。温经汤，温的是任脉的经血，故温经汤有培补先天以滋后天，凯旋升降，交通左右之功。《内经》认为阴阳乃浮沉生死之门，左右为其道路，水火为其征兆，故调阴阳之法门在于其“左右、浮沉、水火”六字，这也是温经汤调和女子阴阳第一主方之原由，正所谓，阴平阳秘，精神乃治。

表5 两组HER-2阳性乳腺癌患者“八纲”条目比较[例（%）]

表6 两组HER-2阳性乳腺癌患者一般安全性指标比较（例）

现代医学认为，HER-2受体是人类表皮生长因子受体EGFR家族的第2个成员，由位于17号染色体q21上，编码分子质量185k的跨膜蛋白表达，有抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞生长等作用，因此对于HER-2阳性的乳腺癌患者，机体免疫功能紊乱更为复杂。HER-2阳性的乳腺癌患者通过体内HER1/HER3/HER4与相应配体结合后，与HER-2形成异二聚体，磷酸化膜内酪氨酸激酶，生长因子受体结合蛋白及其相关衔接蛋白通过SH2结构域连接到HER2的C端激活蛋白SOS，促进Ras释放GDP进而使MEK磷酸化，最终激活MAPK[9]，参与肿瘤的生长、分化、炎症、凋亡等机制。曲妥珠单抗是靶向HER-2 的抗体，临床研究[10]显示，譬如 NCCTG、N9831、HERA、BCIRG006、I-SPY2等均可以明显提高HER-2阳性的乳腺癌患者无病生存期（DFS）和总生存（OS）。HER-2阳性的乳腺癌患者与机体细胞免疫功能低下密切相关，乳腺癌微环境中免疫细胞及细胞因子可有效促进和抑制肿瘤的生长，以T淋巴细胞为主，取决于抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）和T细胞之间3类分子信号的综合作用。其中辅助性细胞T（Th）是参与机体免疫应答的一类重要的免疫调节细胞，而辅助性T细胞17（Thl7）和调节性T细胞（Treg）在炎症及免疫应答过程中发挥了重要的作用[11]。Th17细胞通过其特异性产生的效应因子IL-17发挥致炎作用；IL-17频率增加，抑制活性升高，减弱特异性T淋巴细胞反应，导致肿瘤细胞生长[12-13]。

程序性死亡因子-1是近年来发现的一类能够显著抑制T细胞活化和调节T细胞免疫应答的CD28/B7家族成员。PD-1分子主要在活化的T细胞上表达，PD-1受体可通过与APC表面的配体PD-L1结合而发挥抑制T细胞反应的作用。PD-1可通过与配体PD-L1结合可通过阻断CD28，激活介导的PI3K途径而抑制T细胞的增殖和分化[14]。在有效激活T细胞的信号途径中，负向的协同共刺激分子PD-1及其配体PD-L1的信号途径是最新认为与肿瘤疫苗、双特异性抗体、检查点抑制剂及共刺激分子激动剂等肿瘤免疫治疗方面很有治疗前景的靶点[15-16]。本研究通过中医调节整体“阴阳”平衡观察HER-2阳性的乳腺癌术后患者免疫紊乱情况。治疗48周后，治疗组“里虚寒”构成比较治疗前下降，且与对照组相比有明显差异，显示“温经汤”可以通过“温里、暖肝、运气、活血”来调节人整体的阴阳状态，使偏颇的“表里寒热虚实”趋向平和，达到增强正气、运行气血、通调任脉的作用，即“正气存内，邪不可干”之意。治疗48周后，治疗组外周血PD-1、PD-L1频数均低于对照组同期水平，与基线相比也明显下降。相关研究[17]发现，三阴型乳腺癌中PD-1在HER-2阳性肿瘤表达较高，也有报道[18]称PD-1表达与HER-2的表达呈正相关，与ER表达呈负相关，与PR表达无关，在不同的乳腺癌亚型中无明显差异；而治疗组IL-17频数较对照组明显升高，白细胞也较对照组数目增多，机体整体的免疫功能增强。结果显示“温经汤”治疗对患者已紊乱的免疫内环境有趋向再建平衡作用，可能是通过调节IL-17和PD-1/PD-L1的分泌改善机体免疫功能，或可为乳腺癌综合防治及免疫治疗瓶颈提供较有前景的靶点和方向。

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