五福饮治疗膝骨关节炎大鼠模型实验研究

王敏龙 卢德赵 叶兴法 钱木水 沈钦荣

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是最常见的关节疾病，具有发病率高、致残率高、治疗花费高以及易反复的特点[1]。近年来，中药复方以其多靶点、多途径的治疗优势发挥着重要的临床作用[2]。目前治疗多以“补肾活血学说”、“经筋理论”为依据，以滋补肝肾、祛风除湿、活血通络、循经用药为治则[3]。本课题组通过临床观察发现，随着年龄增加，人体五脏虚损的变化与OA发生有密切联系，并运用“五脏同补”代表方五福饮对其治疗，取得不错疗效[4]。为探讨其可能的作用机制，以Hulth法复制KOA模型，观察五福饮颗粒剂对KOA大鼠炎症因子及骨形态发生蛋白（BMP-2）的影响，为“五脏同补”治疗膝骨关节炎提供实验室依据。

1 实验材料

1.1 动 物 健康SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（220±18）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（许可证号：SCXK（沪）2008-0016）。动物饲养于浙江中医药大学鼠类SPF级实验室（合格证号：SXYK（浙）2013-0184），饲养温度 20～23℃，湿度 50%～60%，光照每12h明暗交替，通风8～15次/h，自由饮食并保证充足的饮水，适应性饲养1周后分组实验。

1.2 药 物 五福饮颗粒剂：党参、熟地、白术、当归、甘草按 3：3：2：2：1 比例配制，五福饮颗粒剂由浙江绍兴景岳堂制药公司提供，颗粒剂1g相当于煎剂药量5g。

1.3 试 剂 鼠白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国Cloud-Clone Corp公司，批号：SEA563Ra），鼠白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国Cloud-Clone Corp公司，批号SEA079Ra），广谱二抗（上海长岛生物技术有限公司，批号D-3004），辣根过氧化酶（上海长岛生物技术有限公司，批号A1820），DAB浓缩型试剂盒（上海长岛生物技术有限公司，批号FL-6001），中性树脂（上海长岛生物技术有限公司，批号：G8590），兔抗大鼠 BMP-2（美国 Abeam 公司，批号 ab14933）。

1.4 仪 器 超低温冷冻储存箱（DW-MW138，中科美菱低温科技股份有限公司），旋涡振荡器（K30，青浦泸西仪器厂），生化培养箱（LRH-250A，广州航信科学仪器有限公司），多功能酶标仪（SpectraMax M3，美国 Molecular Devices公司），正置显微镜（CX41，日本OLYMPUS光学工业株式会社），恒温烘箱（DHG-9023A，上海恒一科学仪器有限公司），石蜡切片机（SQ2125，湖北徕克医疗仪器有限公司），摊片机（Ppthk21B，湖北徕克医疗仪器有限公司），IMS图象分析系统（浙江中医药大学），数码相机（D5100，日本NIKON公司），台式高速冷冻离心机（Eppendorf-5417R，深圳市赛亚泰科仪器设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组及造模 健康SPF级雄性大鼠30只，适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为假手术组10只和造模组20只。造模组大鼠称重后，常规术前准备，Hulth造模法[5]建立KOA模型，取大鼠右膝内侧入路，切断内侧副韧带，剪断前后交叉韧带，再完整剔除内侧半月板。假手术组只做切口暴露关节后缝合。术后给予青霉素4万U肌肉注射，1天2次，连续3天。术后随机按数字表法将造模组20只分成模型组10只和治疗组10只。各组在实验过程中未出现脱落。5只1笼进行喂养，术后1周强迫各组大鼠每天活动1小时，连续驱赶4周。

2.2 药物干预 大鼠药物用量换算[5]采用人和动物的体表面积计算法，人为大鼠的1/6。五福饮颗粒剂成人0.44g/（kg·d），则大鼠为2.64g/（kg·d）。治疗组在造模6周后按2.64g/（kg·d）灌胃，其余各组按10mL/kg蒸馏水灌胃，1天1次，灌胃4周。

2.3 ELISA法检测各组大鼠血清及关节液IL-1β和IL-6浓度 各组药物干预结束1周后，用2%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，腹主动脉取血5～10mL置于抗凝管内，静置30min后，放入3000r/min的离心机，离心15min取血清。处死大鼠立即切取各组大鼠右膝关节，打开关节囊，用2mL生理盐水冲洗关节腔，取约2cm直径10mL一次性无菌尿杯，上置0.25μm一次性过滤器收集关节冲洗液，移液器转移至2.5mL EP管，离心5min，取上清液约1mL。指标测定按照ELISA检测试剂盒说明书进行。在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一和第二孔中分别滴加标准品100μL，接着加标准品稀释液50μL，混匀；然后从第一孔和第二孔中各取100μL分别加到第三、四孔，以此类推至第九、十孔，混匀后从第九、十孔中各取50μL弃掉。在酶标包被板待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再滴加待测样品10μL（样品最终稀释浓度为5倍）。将样品滴加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀（空白对照孔不加样品及酶标试剂）。用封板膜封板后置37℃温育30min，洗涤5次，每孔加入酶标试剂50μL，再温育，洗涤，显色，在酶标仪上于450nm波长处以阴性对照孔调零，检测各孔光密度（OD）值，根据标准液的检测结果得出标准曲线，求出各组样品的实际浓度。

2.4 免疫组化检测大鼠关节软骨BMP-2表达情况关节液收集完后立即用4%中性多聚甲醛固定膝关节标本48h，接着用10%EDTA-2Na对标本脱钙4周，当大头针可以无阻力穿透标本时确认脱钙成功，修剪标本，脱水、石蜡包埋后，右侧股骨内侧髁矢状面切片，二甲苯脱蜡；梯度乙醇脱水；复合抗原修复液（0.01M柠檬酸钠缓冲溶液），50℃孵育15min；3%H2O2中室温孵育10min；含1%牛血清白蛋白（BSA）抗体稀释液稀释的一抗BMP-2（1∶200），阴性对照以PBS代替一抗，4℃孵育过夜；滴加辣根过氧化酶标记广谱二抗工作液，37℃孵育30min；DAB显色；苏木精复染；二甲苯透明，封片，拍片。在400倍镜下每份样本随机选取5个视野，获取图像并编号、存盘。骨形态发生蛋白-2（BMP-2）免疫组化染色阳性结果呈棕黄色，在胞浆表达，主要分布于关节软骨中层和深层。采用Image-Pro Plus软件，计算阳性染色平均光密度值。

2.5 统计学方法应用SPSS20.0软件统计分析。数据以（x±s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）分析组间差异，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Tamhane’s T2法，若不满足正态性时采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠血清及关节液IL-1β和IL-6浓度比较 与假手术组比，模型组和治疗组血清及关节液中IL-1β和IL-6的浓度均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，治疗组血清及关节液中IL-1β和IL-6的浓度均有显著下降（P＜0.01），见表 1～2。

3.2 各组大鼠关节软骨细胞BMP-2表达比较 模型组软骨中BMP-2表达水平低于假手术组（P＜0.01），使用五福饮颗粒剂治疗后，治疗组表达比模型组明显升高（P＜0.01），与假手术组无明显差异（P＞0.05）见封二图 1、2。

4 讨论

KOA 归属于中医“痹症”、“骨痹”、“膝痹”、“痿证”或“痿痹”等范畴，病机为本虚标实，肝肾不足、正气亏虚是其本，风寒湿邪入侵，痰浊内蕴，瘀血阻滞经络为其标，即“本痿标痹”[6]。KOA是一种退行性病变，其患病率随着年龄的增长明显升高，且在诊断标准中明确指出“中老年患者（＞40岁）”为诊断成立的条件之一。可见，增龄衰老是KOA较为确切的发病危险因素。中医认为该病多见于中老年以后，肝气衰，筋不能动，进而肾脏衰，形体皆极。临床多见筋急而挛，膝软活动不利，或痿软而肌力减退等，因而认为其病机为“本痿”。“痿证”是肢体筋脉弛缓，手足痿软无力，肌肉萎缩，不能随意运动的一种病症。陈无择指出“人身有皮毛、血脉、筋膜、肌肉、骨髓，以成其形，内则有肝、心、脾、肺、肾以主之，若随情妄用，喜怒劳佚，以致内脏精血虚耗，使血脉、筋骨、肌肉痿弱无力以运动，故致痿躄，状与柔风脚气相类。柔风脚气，皆外因风寒，正气与邪气相搏，故作肿苦痛，为邪实；痿由内脏不足之所致，但不任用，亦无痛楚，此血气之虚也”，强调痿乃内脏不足，血气之虚所致。故五脏虚损，血气空虚，不荣四末为“痿”病机。中医强调治病求本，故而提出“五脏同补”治疗KOA的观点。

表1 各组大鼠血清IL-1β和IL-6浓度比较（μg/L，x±s）

表2 各组大鼠关节液IL-1β和IL-6浓度比较（μg/L，x±s）

五脏同补的整体观，源于五行五藏、五脏互藏理论。五行五藏，是指五行中的任何一行包括其他四行。张景岳五行五藏的观点，将五行与阴阳紧密结合起来，提出“五行即阴阳之质，阴阳即五行之气，气非质不力，质非气不行”（《类经图翼·运气·五行统论》），将五行与五脏结合起来，即形成了五脏互藏理论[4]。《景岳全书·卷六·脉神章》曰：“凡五脏之气必互相灌溉，故五脏之中，必各兼五气。”同时又指出：“有一脏之偏强，常致欺凌他脏者；有一脏之偏弱；每因受制多虞者。”（《景岳全书·卷二·传忠录·脏象别论》）五福饮为明代著名医家张景岳创制的五脏同补代表方名方，见于《景岳全书·新方八阵·补阵》，由人参、熟地黄、当归、白术、炙甘草组成，主治五脏气血亏损，其中人参补气、养心、养神、生津；熟地质润入肾，为补肾阴之要药；当归补血、活血、养肝；白术益气、健脾、补肺；炙甘草和中补脾、润肺、解毒、调和诸药。五药同用，共奏补益五脏气血之功。实验中人参用党参代替，党参具有补气、养血之效。张景岳称“凡五脏气血亏损者，此能兼治之，足称王道之最”。

白细胞介素-1（IL-1）家族主要包括IL-1α和IL-1β 两种亚型，以 IL-1β 为主。研究[7]表明，IL-1β在OA患者关节液呈高水平表达，且与关节软骨损伤成正相关。其可影响软骨细胞基因的表达抑制软骨的合成代谢[8-9]，同时通过诱导基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）的表达与活化，促进软骨细胞的分解代谢[10]。IL-1β可刺激软骨细胞产生大量NO[11]，通过caspase-8、P38及ERK1/2途径诱导软骨细胞凋亡[12]。此外还可上调促进软骨细胞衰老的Caveolin-1 mRNA和蛋白质水平，加速OA进程[13]。因此，IL-1β被认为是OA病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的最重要细胞因子[14]。白细胞介素-6（IL-6）是另一种重要的炎症介质，正常软骨细胞可产生少量IL-6，高水平时可使软骨及软骨下骨结构改变，刺激软骨细胞增殖，导致骨赘形成[15]。研究[16]证实，IL-6可刺激滑膜增生，激活破骨细胞，形成滑膜血管翳及释放MMPs，从而诱导关节和软骨的破坏。其可与IL-1协同抑制软骨细胞合成蛋白聚糖，导致软骨基质缺失[17]。

BMP-2是转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）超家族成员，是正常胚胎期骨组织及成年期骨修复中的重要蛋白分子[18]。研究[19]表明，BMP-2可刺激软骨蛋白多糖的合成、诱导蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达，诱导间充质干细胞向软骨细胞分化，调节新生软骨细胞表型，使新生软骨内的蛋白多糖和胶原纤维含量更趋近正常[20]，同时可长期维持体外培养的软骨细胞表型，加速全层关节软骨修复，改善修复软骨组织质量[21]。有学者研究[22]认为，BMP-2与骨赘的形成有关，但体外给予不同剂量BMP-2导致骨关节炎骨赘的研究表明了其导致骨赘的作用是有限的[23]。

本实验表明，使用五福饮颗粒剂可降低KOA大鼠血清和关节液 IL-1β、IL-6 含量（P＜0.01），减轻炎症反应，同时上调关节软骨中BMP-2表达（P＜0.01），促进关节软骨修复，从而延缓KOA进程（P＜0.01）。本实验存在样本量少，观察周期短，未对剂量探讨的不足，将在下一步的研究中改进。

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